羅格列酮對(duì)血管再狹窄的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的 PCI術(shù)后再狹窄的預(yù)防和治療問(wèn)題是心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。再狹窄的實(shí)質(zhì)是局部血管損傷后的一種過(guò)度修復(fù)反應(yīng)，其中血管中膜層平滑肌細(xì)胞大量增殖并遷移至內(nèi)膜及隨后細(xì)胞外基質(zhì)的積累是再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究旨在探討PPAR-Y的合成型配體羅格列酮對(duì)體外血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的影響；探討羅格列酮對(duì)球囊損傷大鼠頸動(dòng)脈再狹窄模型中新生內(nèi)膜形成的影響，并進(jìn)一步分析其可能涉及的分子機(jī)制，為PCI術(shù)后再狹窄的防治提供一條新的思路。

2、 方法 1．運(yùn)用改良組織貼塊法進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng)并傳代，綜合應(yīng)用自然純化、機(jī)械刮除、差異貼壁三種方法純化細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和Q—actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定； 2．以第五代純化平滑肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，分別應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)PCNA的表達(dá)，從而從三個(gè)方面反應(yīng)不同濃度(1～lOumol／L)的羅格列酮對(duì)PDGF-BB或

3、bFGF誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的影響； 3．以第五代純化平滑肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，運(yùn)用改良Boyden趨化小室測(cè)試不同濃度(1～10umo1／L)的羅格列酮對(duì)PDGF-BB和bFGF誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞遷移的影響； 4．采用球囊血管內(nèi)膜剝脫法建立大鼠頸總動(dòng)脈再狹窄模型，應(yīng)用免疫組化染色法觀察PPAR-γ受體在血管中的表達(dá)變化； 5．建立動(dòng)物模型后于不同時(shí)間點(diǎn)(7d～28d)取材，HE染色，應(yīng)用病理圖象分析軟件計(jì)算內(nèi)膜與中

4、膜的厚度比(I／M)、內(nèi)膜與中膜的面積比(IA／MA)，觀察羅格列酮(3mg／kg·d，術(shù)前7d至術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn))對(duì)血管損傷后新生內(nèi)膜形成的影響； 6．建立動(dòng)物模型后于不同時(shí)間點(diǎn)(1d～28d)取材，分別應(yīng)用RT-PCR法和Western-b1ot法檢測(cè)c-Fos、P27kip1、MMP-2、TIMP-2的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，觀察這4個(gè)指標(biāo)在血管損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化，并探討羅格列酮對(duì)它們表達(dá)的影響。 結(jié)果

5、 1．原代培養(yǎng)中約90％的組織塊接種存活，培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“谷峰狀”生長(zhǎng)，經(jīng)平滑肌細(xì)胞特異的Q-actin免疫化學(xué)染色后，培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿著色呈陽(yáng)性反應(yīng)，5代左右平滑肌細(xì)胞純度達(dá)98％以上； 2．PDGF-BB(20ng／m1)或bFGF(20ng／m1)可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)G0／Gl期細(xì)胞向S期細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加細(xì)胞核內(nèi)PCNA的表達(dá)，全部P<0．0001；而應(yīng)用羅格列酮預(yù)處理30～45min后，可明顯抑制細(xì)胞的增殖，

6、阻止細(xì)胞由G0／Gl期向S期轉(zhuǎn)化，抑制核內(nèi)PCNA的表達(dá)，并且在1～10umol／L的濃度范圍內(nèi)，其抑制作用呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，全部P<0．000l； 3．PDGF-BB(20ng/m1)或bFGF(20ng/m1)可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的遷移，P<0．000l，而應(yīng)用羅格列酮預(yù)處理30～45min后，可明顯抑制細(xì)胞的遷移，并且在l～10umol／L的濃度范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系，全部P<0．0001； 4．成功建立大

7、鼠左頸總動(dòng)脈再狹窄模型，正常血管中膜層中有少量PPAR-γ受體的表達(dá)，血管損傷后其表達(dá)增加，新生內(nèi)膜中也可見(jiàn)大量PPAR-γ的表達(dá)； 5．球囊損傷后7d可見(jiàn)血管內(nèi)膜增生、新生內(nèi)膜形成，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)(7d～28d)，內(nèi)膜增生更加明顯，后時(shí)間點(diǎn)組的I／M值和IA／MA值較前時(shí)間點(diǎn)組顯著增加，全部P<0．000l；羅格列酮(3mg／kg·d)能夠抑制球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生、新生內(nèi)膜形成，所有對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)上，各給藥組的I／M和IA／M

8、A值較未給藥組均有顯著減少，全部P

9、(Mrna)、P=0．9343(蛋白質(zhì))，但可明顯下調(diào)血管損傷后c-Fos的表達(dá)，在相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)上，羅格列酮各處理組的OD比值較未給藥組明顯降低，P<0．0001； ②血管損傷后P27kip1的Mrna和蛋白質(zhì)的表達(dá)呈一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，二者的趨勢(shì)基本一致。正常血管(假手術(shù)組)中本身就存在P27kip1的基礎(chǔ)表達(dá)，損傷ld后開(kāi)始下降，7d后降至最低點(diǎn)，損傷后14d至28d，P27kip1的表達(dá)逐漸上升，但較對(duì)照組仍有明顯降低，所

10、有P

11、，所有P<0．0001；而損傷后28d組Mrna的表達(dá)與對(duì)照組相比反而降低，P

12、2的表達(dá)，損傷1d后表達(dá)略有升高，其中Mrna的比值與假手術(shù)組相比無(wú)明顯差異，P=0．1052，而蛋白質(zhì)的OD比值較假手術(shù)組增加，P<0．0001；損傷4d后表達(dá)繼續(xù)升高，7d左右達(dá)高峰，損傷后14d至28d，TIMP-2的表達(dá)逐漸下降，但較對(duì)照組仍有明顯升高，所有P<0．0001；其中28d組與21d組相比，僅略有下降，28d組Mrna的OD比值與2ld組相比無(wú)明顯差異，P=O．1709，而蛋白質(zhì)的OD比值較2ld組減少，P<0．00

13、0l；羅格列酮處理后對(duì)假手術(shù)組和各血管損傷組的TIMP-2的Mrna和蛋白質(zhì)的表達(dá)無(wú)明顯影響，P=O．0679(Mrna)、P=O．2504(蛋白質(zhì))。 結(jié)論 1．羅格列酮能夠在體外抑制PDGF-BB或Bfgf誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖，阻止細(xì)胞由G0／Gl期向S期的轉(zhuǎn)化，抑制細(xì)胞核內(nèi)PCNA的表達(dá)，并且在1～10umol／L的濃度范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。 2．羅格列酮能夠在體外抑制PDGF-BB或Bfgf誘

14、導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的遷移，并且在l～lOumol／L的濃度范圍內(nèi)呈明顯的劑量依賴(lài)關(guān)系。 3．羅格列酮(3mg／kg·d)能夠抑制大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的形成，減輕再狹窄的發(fā)生。其涉及的分子機(jī)制可能是：血管損傷后PPAR-γ的表達(dá)增加，PPAR-γ與配體羅格列酮結(jié)合后被激活，參與調(diào)控c-Fos、P27kip,、MMP-2等多種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使c-Fos的表達(dá)減少，P27kip1的表達(dá)上調(diào)，從而阻止細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化