重組乳腺癌EZH23’UTR慢病毒載體構(gòu)建及其在MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá).pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶人 EZH23'非翻譯區(qū)（3'UTR）的Ctx-慢病毒篩選載體（Ctx-pLV）并實(shí)現(xiàn)該重組體在人乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中穩(wěn)定整合。
　　方法：1、提取組織總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），獲得目的片段 EZH23'UTR，回收純化；以 T4連接酶連接目的片段與克隆克隆 pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，菌落PCR鑒定重組克?。怀樘嶂亟M克隆質(zhì)粒DNA，應(yīng)用限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ和B

2、amHⅠ對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定陽(yáng)性克隆；對(duì)鑒定出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒（Amp+）培養(yǎng)基上，抽提質(zhì)粒DNA并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ對(duì)其和Ctx-慢病毒載體雙酶切，分別回收純化，得到目的片段EZH23'UTR和慢病毒雙粘性質(zhì)粒，以T4連接酶將二者連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取重組病毒載體質(zhì)粒DNA，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切篩選鑒定陽(yáng)性重組慢病毒質(zhì)粒Ctx-pLV-EZH23′UTR。3、將重組慢病毒質(zhì)粒Ctx-pLV-EZH23′UT

3、R和輔助包裝系統(tǒng)共感染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集病毒顆粒，根據(jù)慢病毒載體上的CMV啟動(dòng)子表達(dá)量檢測(cè)病毒滴度。使病毒顆粒感染乳腺癌 MCF-7細(xì)胞后，通過嘌呤霉素篩選穩(wěn)定整合的乳腺癌細(xì)胞，抽提細(xì)胞的基因組，用 Real-Time PCR檢測(cè) Ctx-pLV-EZH23′UTR是否整合入細(xì)胞MCF-7中。
　　結(jié)果：1、進(jìn)PCR擴(kuò)增后得到大小約為275bp的目的片段，與預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的片段大小一致。2、目的片段與線性慢病毒載體定向連接

4、后，對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)性菌落PCR鑒定和測(cè)序結(jié)果證實(shí)，目的片段成功構(gòu)建慢病毒載體上。3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒滴度為4.3×109copy/ml。篩選穩(wěn)定整合MCF-7細(xì)胞的最佳濃度為0.2μg/ml。重組病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo) MCF-7后，Real-Time PCR檢測(cè) EZH23'UTR成功整合到乳腺癌MCF-7細(xì)胞中。
　　結(jié)論：成功獲得目的片段EZH23′UTR；成功構(gòu)建MiRNA文庫(kù)篩選用Ctx-pLV-EZH23′UTR，并實(shí)