轉(zhuǎn)染反義c-erbB-2 mRNA對子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞株生長抑制作用的研究.pdf

1、目的:基因的突變及過渡表達(dá)導(dǎo)致的癌基因激活是多數(shù)腫瘤發(fā)病的重要因素。由于mRNA較DNA更易有效地進(jìn)行操控，因而通過阻斷基因的蛋白合成來有效地抑制相關(guān)基因就成為最近研究的熱點(diǎn)。目前，通過阻斷已發(fā)生突變或過渡表達(dá)基因mRNA的方法在治療腫瘤、心血管性疾病及病毒性疾病等的研究中已有大量的報(bào)。反義技術(shù)具有選擇性高、對靶目標(biāo)親和力強(qiáng)、生效快速、機(jī)制確切、易于操控及副作用少等特點(diǎn)，從而使其成為目前有效地抑制相關(guān)基因的常用的方法，并且在乳腺癌及卵巢

2、癌等腫瘤的研究中已取得了可喜的成果。然而，在子宮內(nèi)膜癌的研究中還未見相應(yīng)的報(bào)道。已知c-erbB-2(HER-2/neu)是子宮內(nèi)膜癌主要的原癌基因，在內(nèi)膜癌的生物學(xué)行為中起著重要的作用，其過度表達(dá)是內(nèi)膜癌預(yù)后不良的重要因素。因而，本研究的目的即為評價轉(zhuǎn)染c-erbB-2反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASODNs)對高分化子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA細(xì)胞株及中分化子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞株生長抑制作用

3、的效果。
　　 方法:
　　 1.C-erbB-2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)以及與內(nèi)膜癌臨床病理因素之間的關(guān)系
　　 免疫組化：通過免疫組化S-P方法檢測C-erbB-2蛋白在10例子宮內(nèi)膜不典型增生及31例不同期別、不同組織分級、不同肌層浸潤深度的子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)強(qiáng)度與子宮內(nèi)膜癌臨床及病理因素之間的關(guān)系。
　　 2.轉(zhuǎn)染反義c-erbB-2 mRNA對高分化子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA細(xì)胞株及

4、中分化HEC-1A細(xì)胞株生長抑制作用的研究
　　 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Gibco)及50μg/ml青霉素和鏈霉素的DMEM(Gibco)培養(yǎng)基中。孵箱溫度為37℃，CO2濃度為10％，每周傳代2次。培養(yǎng)細(xì)胞用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.2免疫組化
　　 ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片48h，待玻片細(xì)胞融合率達(dá)75％以上后，采用S

5、-P法免疫組化檢測c-erbB-2蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況。
　　 2.3 C-erbB-2 ASODNs轉(zhuǎn)染ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞
　　 上述培養(yǎng)細(xì)胞于對數(shù)生長期，經(jīng)0.25％胰酶消化后加入DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后，接種于96孔板，每孔接種5×103個細(xì)胞加100ulDMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，待細(xì)胞融合率達(dá)90％以上時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine2000。
　　 2.

6、4透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化
　　 兩種培養(yǎng)細(xì)胞于對數(shù)生長期經(jīng)0.25％胰酶消化后，DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于A、B、C、D、E及a、b、c、d、e、10個培養(yǎng)瓶內(nèi)(75cm2)，每瓶接種細(xì)胞數(shù)為1×107，加20ml DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。待融合率達(dá)90％以上后，吸凈培養(yǎng)液，5ml DM液輕輕沖洗細(xì)胞表面2次。 A/a瓶內(nèi)加入10 ml DM液，作為正常對照。 B/b、C/c、D/d瓶分別加入10ml

7、DM液稀釋的濃度為0.3uM的ASODNs/lipofectamine2000轉(zhuǎn)染液、ASODNs對照液、SODNs/lipofectamine2000轉(zhuǎn)染液，E/e瓶加入10 ml相應(yīng)濃度的lipofectamine2000對照液。培養(yǎng)24h后，每瓶再加入10ml含10％胎牛血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。收集細(xì)胞行透射電鏡檢測。
　　 2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
　　 將兩種細(xì)胞接種于6孔板的5個孔內(nèi)

8、，標(biāo)記為A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1。每孔細(xì)胞密度為1×106。 A1/a1、B1/b1、C1/c1、D1/d1、E1/e1分別為正常對照，ASODNs轉(zhuǎn)染，ASODNs對照，SODNs轉(zhuǎn)染，及l(fā)ipofectamine2000對照。轉(zhuǎn)染濃度為0.3uM。轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。
　　 2.6 RT-PCR assay
　　 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及細(xì)胞收集同流式細(xì)胞術(shù)步驟，每一標(biāo)本

9、含1x106個細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞消化、收集、洗滌、沉淀后以Trizol(Invitrogen)試劑提取各標(biāo)本總RNA(詳見試劑操作說明)。采用TaKaRa試劑盒(AMV，TaKaRa Bio.，Japan)行RT-PCR檢測c-erbB-2 mRNA表達(dá)變化情況。
　　 2.7 western blot分析
　　 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、收集及洗滌同電鏡步驟。每一標(biāo)本1×107細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞行western blot檢測c-er

10、bB-2蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.C-erbB-2在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)以及與內(nèi)膜癌臨床病理因素之間的關(guān)系
　　 1.1 c-erbB-2在子宮內(nèi)膜非典型增生及子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)c-erbB-2在子宮內(nèi)膜非典型增生及內(nèi)膜癌組織中的陽性表達(dá)率分別為40％及58％，二者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 1.2子宮內(nèi)膜癌中c-erbB-2的表達(dá)與臨床、病理因素的相關(guān)性c-erbB-2

11、在子宮內(nèi)膜癌中陽性表達(dá)率與腫瘤的病理組織分級呈正相關(guān)(P＜0.05)，其陽性表達(dá)率隨腫瘤病理分級的增高而增高。 c-erbB2的陽性表達(dá)率與患者的年齡、腫瘤浸潤肌層深度、激素受體狀態(tài)(ER、PR)、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、臨床手術(shù)-病理分期無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 2、轉(zhuǎn)染反義c-erbB-2 mRNA對高分化子宮內(nèi)膜癌ISHIKAWA細(xì)胞株生長的抑制作用
　　 2.1免疫組化
　　 c-erbB-2蛋白在ISH

12、IKAWA及HEC-1A細(xì)胞膜上呈陽性表達(dá)。
　　 2.2轉(zhuǎn)染c-erbB-2 ASODNs后光鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化
　　 隨著轉(zhuǎn)染ASODNs濃度由0.1uM～0.6uM逐漸增加，兩種細(xì)胞均逐漸呈現(xiàn)皺縮、破壞甚至崩解。而未加轉(zhuǎn)染試劑單純用0.6uM ASODNs處理的細(xì)胞、0.6uM SODNs轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及單純用轉(zhuǎn)染0.6uM ASODNs所需濃度的Lipofectamine2000處理的細(xì)胞其光鏡下形態(tài)學(xué)變化與正常對

13、照細(xì)胞差異不大。
　　 2.3轉(zhuǎn)染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化
　　 轉(zhuǎn)染0.3uM c-erbB-2 ASODNs后ISHIKAWA及HEC-1A細(xì)胞漿內(nèi)均發(fā)生明顯空泡變性、細(xì)胞器消失、胞核明顯皺縮、結(jié)構(gòu)消失。未加轉(zhuǎn)染試劑單純用0.3uM ASODNs處理的細(xì)胞其胞漿內(nèi)僅出現(xiàn)輕度的空泡變性，細(xì)胞器存在，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰。而轉(zhuǎn)染0.3uM SODNs的細(xì)胞及單純用轉(zhuǎn)染0.3uM AS

14、ODNs所需濃度的Lipofectamine2000處理的細(xì)胞其超微結(jié)構(gòu)與正常對照細(xì)胞相比無明顯變化。
　　 2.4轉(zhuǎn)染0.1uM～0.6uM c-erbB-2 ASODNs后MTr檢測細(xì)胞生長抑制情況
　　 隨著ASODNs轉(zhuǎn)染濃度的增加，兩種細(xì)胞生長抑制強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)。而SODNs轉(zhuǎn)染組及單純用Lipofectamine2000處理組，隨著濃度的增加細(xì)胞生長抑制性表現(xiàn)不明顯。
　　 2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞

15、凋亡率用0.3uM ASODNs轉(zhuǎn)染兩種細(xì)胞后，其凋亡率較其它組明顯升高。
　　 2.6 RT-PCR及Western blot分析
　　 轉(zhuǎn)染0.3uM ASODNs的兩種細(xì)胞，其c-erbB-2 mRNA及蛋白表達(dá)量較其它組明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.c-erbB-2在子宮內(nèi)膜癌中陽性表達(dá)率與腫瘤的病理組織分級呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 2.隨著轉(zhuǎn)染ASODNs濃度由0.1uM～0.6uM逐