改良的氣體環(huán)境對(duì)體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、在組織工程瓣膜（tissue engineering heart valve，TEHV）的研究過(guò)程中，如何短時(shí)間獲取大量功能狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），維持MSCs的原始狀態(tài)，及控制MSCs分化方向是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。影響MSCs生長(zhǎng)、功能狀態(tài)及分化的因素很多，包括O2濃度、PH值、溫度、生長(zhǎng)因子、血清、培養(yǎng)基、剪切力、細(xì)胞密度等。微環(huán)境中O2濃度及PH值是非常重要因素：O2對(duì)MS

2、Cs的影響是多個(gè)方面的，適當(dāng)?shù)腛2濃度可以促進(jìn)MSCs的增殖、分化、原始狀態(tài)的維持；MSCs對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的PH值的變化非常敏感，不同PH值對(duì)MSCs的增殖、分化及生物學(xué)功能有著顯著影響。目前傳統(tǒng)的細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境中O2濃度約為21％，CO2濃度約為5％，所用培養(yǎng)基PH值為7.2～7.4。而人體正常組織和組織間隙中的O2濃度3％～9％，骨髓腔內(nèi)O2濃度1％～7％；動(dòng)脈血CO2濃度約5％,靜脈血CO2濃度約6％,骨髓腔內(nèi)CO2濃度約7％；人體

3、動(dòng)靜脈血液及骨髓腔內(nèi)pH值恒定在7.20～7.50間。目前，低氧環(huán)境能顯著影響干細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)因子的分泌，但未見(jiàn)低氧對(duì)種子細(xì)胞黏附功能影響的研究報(bào)道。為此，我們分別采用6％O2的培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)MSCs，探討低氧環(huán)境對(duì)MSCs增殖功能及粘附功能影響。同時(shí)針對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)液如DMEM,DF-12,M199等均隨著使用或存放時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液的pH值會(huì)明顯升高，我們首次嘗試7％CO2環(huán)境來(lái)增強(qiáng)培養(yǎng)液中CO2/HCO3-緩沖能力，穩(wěn)定培養(yǎng)液p

4、H值，探討此種穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)MSCs增殖及細(xì)胞原始狀態(tài)的影響，旨在探索合適的細(xì)胞培養(yǎng)的條件。
　　第一部分：小鼠MSCs細(xì)胞分離、純化、擴(kuò)增并鑒定：經(jīng)Percoll密度梯度離心和貼壁生長(zhǎng)的方法從采集的小鼠骨髓液中提取，倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過(guò)免疫組化及流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：選取的6個(gè)培養(yǎng)瓶的小鼠MSCs，進(jìn)行免疫組化染色顯示：ɑ-SMA,Vimentin均呈陽(yáng)性表達(dá)；小鼠MSCs流式細(xì)胞儀鑒定示：CD29,C

5、D44,CD90及CD105呈現(xiàn)高度陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為92.7％，99.6％，99.5％及99.4％，而CD34和CD45陽(yáng)性表達(dá)率僅分別為4.6％和3.2％。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來(lái)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　第二部分：6％O2與21％O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)量的比較：兩組間各挑選生長(zhǎng)良好的3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，一共分為6個(gè)對(duì)照組，分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，粘附實(shí)驗(yàn)，及通過(guò)Western-blotti

6、ng測(cè)定FN及VN的表達(dá)，初步評(píng)價(jià)兩種不同O2環(huán)境下MSCs的增殖、分泌及粘附功能狀態(tài)。
　　結(jié)果：6％O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較21％O2有更強(qiáng)的增殖能力(p<0.05)、粘附能力(p<0.05)及分泌功能(p<0.05)。
　　第三部分：7％CO2與5％O2條件下小鼠MSCs增殖能力及OCT-4蛋白表達(dá)量的比較：兩組間各挑選生長(zhǎng)良好的3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，一共分為6個(gè)對(duì)照組，分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，及通過(guò)Western-bl

7、otting測(cè)定OCT-4蛋白的表達(dá)，初步評(píng)價(jià)兩種不同CO2環(huán)境下MSCs的增殖及干細(xì)胞原始狀態(tài)的維持。
　　結(jié)果：7％CO2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5％CO2有更強(qiáng)的增殖能力(P<0.05)；同時(shí)OCT-4蛋白的表達(dá)含量也較高，表明7％CO2條件更有利于小鼠MSCs原始狀態(tài)的維持(P<0.05)。
　　第四部分：7％CO2+6％O2與5％CO2+6％O2條件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始狀態(tài)維持的比較：兩組間各挑選生長(zhǎng)良

8、好的3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，一共分為6個(gè)對(duì)照組，分別進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，粘附實(shí)驗(yàn)，及通過(guò)Western-blotting測(cè)定FN及OCT-4的表達(dá)，初步評(píng)價(jià)兩種不同氣體環(huán)境下MSCs的增殖、粘附功能及原始狀態(tài)維持。
　　結(jié)果：7％CO2+6％O2條件下培養(yǎng)的小鼠MSCs較5％CO2+6％O2有更強(qiáng)的增殖能力(P<0.05)及粘附能力(P<0.05)，同時(shí)OCT-4的表達(dá)更高(p<0.05)。
　　結(jié)論：O2和PH值是細(xì)胞生長(zhǎng)的重要的微