體外巖藻糖基化修飾細胞表面CD44分子促進人脂肪來源干細胞體內(nèi)遷移成骨的實驗研究.pdf

1、本文分三個部分進行探討：
　　第一部分:hASCs和HUVEC的分離，培養(yǎng)，鑒定
　　目的：1.建立體外分離、培養(yǎng)、獲得人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hASCs)的方法，并對其形態(tài)、免疫表型、生物學(xué)特性進行觀察和研究。
　　2.建立體外分離培養(yǎng)獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell

2、,HUVEC)的方法，并對其形態(tài)、生物學(xué)特性進行觀察和研究。
　　方法：1.抽脂術(shù)獲得大量脂肪，用0.15％I型膠原酶消化法獲得大量人脂肪間充質(zhì)干細胞行并進行體外培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)特征；用CCK-8細胞增殖試驗繪制生長曲線；用流式細胞儀檢測細胞表面間充質(zhì)干細胞相關(guān)抗原；并分別進行成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定其多向分化潛能。
　　2.將獲取的新鮮胎兒臍帶使用0.2％I型膠原酶消化法獲得大量臍靜脈內(nèi)皮細胞行并進行體外培

3、養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察其細胞形態(tài)特征，并通過DiI-Ac-LDL攝取實驗進行鑒定。
　　結(jié)果：1.通過分離培養(yǎng)，獲得了大量旋渦狀生長的成纖維樣細胞。CCK-8法顯示細胞增殖能力強。流式鑒定結(jié)果顯示細胞表面CD29、CD44陽性；CD45、HLA-DR陰性。培養(yǎng)的細胞在特定誘導(dǎo)條件下，具有向骨細胞和脂肪細胞分化的潛能。證明該方法所培養(yǎng)的細胞為臍靜脈內(nèi)皮細胞。
　　2.通過分離培養(yǎng)，獲得了大量鵝卵石樣細胞。熒光顯微鏡下觀察其具有

4、攝取DiI-Ac-LDL的能力，證明該方法所培養(yǎng)的細胞為臍靜脈內(nèi)皮細胞。
　　結(jié)論：建立了高效穩(wěn)定的分離、培養(yǎng)人脂肪間充質(zhì)干細胞及人臍靜脈內(nèi)皮細胞的方法，為后續(xù)實驗提供了種子細胞。
　　第二部分:巖藻糖基化hASCs的體外功能研究
　　目的：通過應(yīng)用糖基化工程，體外巖藻糖基化處理人脂肪間充質(zhì)干細胞（hASCs），將其表面的CD44分子轉(zhuǎn)換為HCELL分子，從而提高hASCs與E選擇素結(jié)合能力，為功能研究及體內(nèi)研究奠定基

5、礎(chǔ)。
　　方法：建立α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶以及相應(yīng)底物的酶化體系。使用流式細胞儀檢測hASCs表面粘附因子的表達情況。將巖藻糖基化處理后的hASCs進行體外功能試驗，包括流式細胞技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、靜態(tài)及動態(tài)粘附試驗，驗證其唾液酸化LewisX（sLeX）的表達及具有E選擇素結(jié)合能力。并使用臺酚藍染色法、CCK-8法、誘導(dǎo)分化檢測巖藻糖基化處理是否影響細胞的增殖、活性及多向分化能力。
　　結(jié)果：流式結(jié)果顯示未處理的hAS

6、Cs高表達CD29、CD44、CD49d、CD49e，低表達或者不表達唾液酸化LewisX（sLeX）、PSGL-1、CXCR4、β7，無E選擇素結(jié)合力。然而，經(jīng)過體外巖藻糖基化處理后的hASCs高表達sLeX， E選擇素結(jié)合力顯著升高。免疫印跡法也證實了這一結(jié)果。靜態(tài)及動態(tài)粘附實驗均證明與未處理組相比，巖藻糖基化處理后的hASCs在靜態(tài)及動態(tài)條件下，對E選擇素結(jié)合力顯著升高。同時，我們還證實了巖藻糖基化處理不會影響細胞的增殖、活性及多

7、向分化能力。
　　結(jié)論：巖藻糖基化處理后的hASCs高表達sLeX，并顯著增加E選擇素結(jié)合力，并不會影響細胞的增殖、活性及多向分化能力。
　　第三部分:巖藻糖基化hASCs的體內(nèi)功能研究
　　目的：通過體外巖藻糖基化處理hASCs，使其表面強制表達HCELL分子，從而提高hASCs的E選擇素結(jié)合能力，最終促進其向骨歸巢能力。
　　方法：1.將DiI熒光標記過的巖藻糖基化處理后hASCs通過尾靜脈回輸至NOD/SC

8、ID小鼠體內(nèi)，16小時后將處死小鼠，取得股骨骨髓，通過流式細胞術(shù)檢測DiI陽性細胞所占比例。
　　2.將巖藻糖基化處理后hASCs通過尾靜脈回輸至NOD/SCID小鼠體內(nèi)，3個月后將小鼠處死，取出顱骨脫鈣，OCT包埋，制成冰凍切片。運用免疫熒光法檢測歸巢hASCs的定植位置及成骨分化能力。
　　結(jié)果：1.流式細胞術(shù)的結(jié)果顯示：巖藻糖基化處理組的骨髓內(nèi)DiI染色陽性細胞的所占比例約為0.77+0.10％；未處理組的骨髓內(nèi)DiI

9、染色陽性細胞的所占比例約為0.09+0.02％。上述結(jié)果表明，巖藻糖基化處理可以顯著提高hASCs的短期歸巢能力。
　　2.通過共聚焦顯微鏡觀察到的免疫熒光結(jié)果顯示：巖藻糖基化組的小鼠顱骨骨內(nèi)膜表面可以觀察到稀少的人骨鈣素陽性的成骨細胞，而在未處理組及對照組均未發(fā)現(xiàn)人骨鈣素陽性的細胞。上述結(jié)果證明經(jīng)過巖藻糖基化處理后的hASCs不僅能夠促進其向骨歸巢能力，并仍能保留其向成骨分化的能力。
　　結(jié)論：巖藻糖基化處理可以顯著提高h