心腔內(nèi)超聲輻照增加基因表達(dá)治療犬心肌梗死.pdf

1、背景和目的：近年，國內(nèi)外學(xué)者嘗試用基因治療恢復(fù)心肌梗死(MI)病人的血流灌注、改善預(yù)后。基因的轉(zhuǎn)染表達(dá)是治療關(guān)鍵，基因直接以裸露 DNA 的形式轉(zhuǎn)移比病毒載體安全，但缺點是轉(zhuǎn)染和表達(dá)效率低，難以達(dá)到治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，超聲的生物物理效應(yīng)可明顯促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染表達(dá)，但用傳統(tǒng)的體外超聲輻照心臟，因聲窗等因素影響，最終到達(dá)心肌的聲能量、輻照效果難以準(zhǔn)確控制。另外，在基因治療缺血性心臟病的臨床運用中，需要建立安全簡便的基因靶向?qū)敕椒ā?針

2、對基因治療效應(yīng)性、投遞途徑等存在的問題，本研究將基因治療與介入超聲結(jié)合，在介入導(dǎo)管頂端安裝超聲換能器，并配置投送基因的特制微型注射針，研制成超聲導(dǎo)管：深入心腔內(nèi)部經(jīng)導(dǎo)管中微型針將基因注射到心肌局部，之后在心腔內(nèi)發(fā)射超聲近距離輻照心肌促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染表達(dá)；實驗中，我們也觀察超聲造影劑微泡(MB)攜基因直接注射到心肌后的成像效果，探討微泡攜基因直接注射到心肌后協(xié)同心腔內(nèi)超聲輻照對基因表達(dá)的影響。 方法： 1、正常活體犬介入實驗：

3、 犬17只，分為5組(n=3-4)分別為：①綠色熒光蛋白裸質(zhì)粒(EGFP)+MB+ 心腔內(nèi)超聲輻照組(US)，②EGFP+US，③EGFP+MB，④單純EGFP注射組，⑤空白對照組 (注射等量生理鹽水)。 在X線影像引導(dǎo)下，超聲導(dǎo)管經(jīng)左頸總動脈的9F血管鞘進(jìn)入犬左心室腔，經(jīng)微型針分5個點向心肌注入MB和/或EGFP的混合液，每個注射點注射量為100μL(含EGFP100ug)，EGFP/MB/US 及EGFP/US組在注

4、射完畢后，即刻以超聲導(dǎo)管在心腔內(nèi)發(fā)射超聲輻照每個注射點部位的心肌 1 分鐘(4.3MHz/1.0 W/cm<'2>)，其他2組僅注射基因不行超聲輻照。觀察：①超聲導(dǎo)管經(jīng)皮心肌內(nèi)注射、在心腔內(nèi)輻照心肌的可行性及準(zhǔn)確性；②MB結(jié)合基因注射到心肌后的成像效果、分布范圍。術(shù)后48h：③檢測心肌注射部位EGFP mRNA、蛋白表達(dá)；④探討心腔內(nèi)超聲單獨輻照以及協(xié)同心肌內(nèi)注射 MB 對 EGFP 基因表達(dá)的影響；⑤觀察心腔內(nèi)超聲輻照對心肌組織細(xì)胞的

5、生物效應(yīng)，評估超聲導(dǎo)管的安全性；⑥探討心腔內(nèi)超聲輻照增加EGFP在心肌表達(dá)的生物機(jī)制。 2、犬MI模型的介入實驗： 采用冠狀動脈結(jié)扎法建立犬MI的動物模型，分為5組(n=3-5)：①肝細(xì)胞生長因子裸質(zhì)粒(HGF)+MB+US組，②HGF+US組，③單純HGF治療組，另設(shè)假手術(shù)組(Sham組)與MI無干預(yù)組。用上述注射方法，在HGF基因治療組分5個點向心肌內(nèi)注入MB和/或HGF混合液(每個點100μL，含HGF100ug)

6、，HGF/MB/US、HGF/US兩組注射后行心腔內(nèi)超聲輻照，單純HGF治療組僅注射 HGF 不行超聲輻照，術(shù)后28天檢測：①HGF的mRNA及蛋白在犬缺血心肌的表達(dá)；②心肌梗死面積、左右心室重量指數(shù)、心肌羥脯氨酸含量(HC)和心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)變化；③缺血心肌中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、CD31、血小板八因子的表達(dá)，計算微血管計數(shù)。 結(jié)果：① 研制的超聲導(dǎo)管經(jīng)常規(guī)介入法順利進(jìn)入犬左心室腔，向心肌內(nèi)注射基因、

7、在心腔內(nèi)發(fā)射超聲輻照心肌的實驗過程中犬生命體征平穩(wěn)，無嚴(yán)重并發(fā)癥；②微泡攜基因注射到心肌可在局部清晰顯影，診斷超聲可清楚觀察微泡在心肌內(nèi)的成像效果、分布層次和范圍；③與單純EGFP注射組比較，EGFP/MB/US組 EGFP 的mRNA表達(dá)增加約8倍，熒光強(qiáng)度增加約8.6倍(p<0.01)，EGFP/US 組EGFPmRNA表達(dá)增加約6倍，熒光強(qiáng)度增加約5.1倍(P<0.01)；單純EGFP注射組與 EGFP/MB組的EGFP mRNA

8、表達(dá)、熒光強(qiáng)度無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；對照組無EGFP表達(dá)。④EGFP僅在注射部位心肌表達(dá)，其他臟器無EGFP沉積及表達(dá)，各實驗組犬肝、腎、肺臟組織無異常病理改變；⑤心腔內(nèi)超聲輻照后心肌輕微充血，少量紅細(xì)胞溢出；透射電鏡提示心肌細(xì)胞及線粒體膜的通透性增加，心肌細(xì)胞漿內(nèi)可見小空泡形成；心肌內(nèi)直接注射微泡協(xié)同心腔內(nèi)超聲輻照后上述生物效應(yīng)更明顯；⑥心腔內(nèi)超聲輻照心肌后增加內(nèi)源性VEGF及HSP70表達(dá)；VEGF及HSP70表達(dá)均以EGF

9、P/MB/US組最明顯，其次為EGFP/US組(P<0.01)，EGFP/MB組僅有少量VEGF及HSP70表達(dá)，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；單純EGFP注射組及對照組無VEGF、HSP70表達(dá)。⑦EGFP/MB/US組心肌中EGFPmRNA表達(dá)與VEGF及HSP70mRNA表達(dá)呈明顯正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.76、0.75(P<0.05)；EGFP/US組心肌中EGFPmRNA表達(dá)也與VEGF及HSP70mRNA表達(dá)呈明顯

10、正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.75、0.77(P<0.05)；EGFP/MB組EGFPmRNA表達(dá)與VEGF、HSP70mRNA表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。 在犬MI實驗中：①心腔內(nèi)超聲輻照后增加HGFmRNA及蛋白在犬缺血心肌的表達(dá)；與單純HGF治療組比較，HGF/MB/US組HGF的mRNA表達(dá)增加約6倍，蛋白增加約4.7倍(P<0.01)；HGF/US組HGFmRNA及蛋白表達(dá)則分別增加約4倍、3.3倍(P<0.01)。②HGF基

11、因治療能上調(diào)心肌中CD31、VEGF的mRNA表達(dá)，增加犬MI后毛細(xì)血管新生，以HGF/MBUS組最明顯(P<0.01)，其次為HGF/US組(P<0.01)，單純HGF裸質(zhì)粒注射組CD31、VEGF的mRNA表達(dá)及血管新生較MI組增加，但低于其他2個HGF治療組(p<0.01)。③HGF基因治療也降低左右心室重量指數(shù)、HC和Ⅰ型、Ⅲ型膠原的CVF，改善犬MI后心臟重塑；所有治療效應(yīng)均以HGF/MB/US組最明顯。 結(jié)論：超聲導(dǎo)