Wistar大鼠出生前后PFOS暴露的神經(jīng)行為毒性及機(jī)理研究.pdf

1、全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)由于其良好的表面活性和穩(wěn)定性曾被廣泛應(yīng)用于滅火劑、紡織用品、殺蟲(chóng)劑等日用品和工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)領(lǐng)域。毒理學(xué)研究表明PFOS是一類(lèi)具有全身多臟器毒性的環(huán)境污染物，斯德哥爾摩公約已于2009年5月正式將PFOS列入持久性有機(jī)污染物名單。PFOS可以通過(guò)胎盤(pán)屏障和母乳傳遞進(jìn)入胎兒和嬰幼兒體內(nèi)，并能夠通過(guò)血腦屏障在其腦部蓄積，進(jìn)而對(duì)早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育造成影響。但目前有關(guān)PFOS

2、發(fā)育神經(jīng)毒性作用機(jī)制的研究仍非常有限。
　　本論文將圍產(chǎn)期Wistar母鼠通過(guò)飲水暴露于PFOS，將仔鼠建立交叉哺育模型，比較仔鼠出生前和/或出生后PFOS暴露的神經(jīng)行為毒性效應(yīng)，確定PFOS發(fā)育神經(jīng)毒性的關(guān)鍵作用時(shí)期，并從神經(jīng)發(fā)育、海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度探討發(fā)育期PFOS暴露的神經(jīng)毒性作用機(jī)制。主要內(nèi)容包括:
　　(1)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析手段，考察PFOS在仔鼠海馬組織中的蓄積水平和特征。結(jié)果

3、顯示:在出生后第一天(postnatal day1，PND1)，仔鼠海馬組織中PFOS濃度高于血清，原因可能為血腦屏障建立前細(xì)胞膜通透性較高，提示腦組織發(fā)育期PFOS較高的靶器官蓄積水平和潛在的神經(jīng)毒性效應(yīng)。持續(xù)暴露組和出生前暴露組仔鼠海馬中PFOS濃度在仔鼠出生后呈下降趨勢(shì)，出生后暴露組仔鼠海馬中PFOS濃度隨時(shí)間逐漸升高。至PND35，出生前暴露組海馬中PFOS濃度顯著低于出生后暴露組。
　　(2)通過(guò)評(píng)價(jià)仔鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

4、，研究出生前后PFOS暴露對(duì)仔鼠的神經(jīng)行為毒性效應(yīng)。抓力結(jié)果顯示仔鼠肌力未受到顯著影響，水迷宮實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)平臺(tái)測(cè)試表明仔鼠的游泳能力未受顯著影響。但水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，出生前和/或出生后PFOS暴露能夠?qū)е伦惺罂臻g學(xué)習(xí)記憶能力的下降。盡管出生前暴露組仔鼠海馬中的PFOS濃度在PND35顯著低于出生后暴露組，但出生前暴露組仔鼠神經(jīng)行為損傷程度多高于或相當(dāng)于出生后暴露組，這提示出生前PFOS暴露能夠?qū)ψ惺笊窠?jīng)系統(tǒng)功能造成長(zhǎng)

5、期影響，表明胚胎期是PFOS發(fā)育神經(jīng)毒性的關(guān)鍵作用時(shí)期。
　　(3)通過(guò)分析神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵蛋白和基因的差異表達(dá)，闡明PFOS神經(jīng)行為毒性與突觸發(fā)育之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示:在PND35，生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)、神經(jīng)細(xì)胞粘附因子1(Neural cell adhesion molecule1，NCAM1)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)和腦

6、源性細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵因子的蛋白水平均表達(dá)下調(diào)，而相應(yīng)基因(gap-43、ncaml、gnf、bdnf)表達(dá)上調(diào)，這說(shuō)明PFOS能夠通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄后和翻譯的進(jìn)程，抑制神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從而影響仔鼠的神經(jīng)行為。出生前暴露組神經(jīng)發(fā)育關(guān)鍵因子的變化程度與出生后暴露組相當(dāng)，甚至更為嚴(yán)重，同樣提示了胚胎期PFOS暴露的高風(fēng)險(xiǎn)性。

7、r>　　(4)研究出生前后PFOS暴露對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，從細(xì)胞水平闡明PFOS神經(jīng)行為毒性的作用機(jī)制。結(jié)果顯示:PFOS造成PNDs1、7、35海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡不同程度的升高，僅出生前暴露PFOS同樣能夠造成仔鼠出生后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca2+]i)變化趨勢(shì)與凋亡類(lèi)似。對(duì)鈣離子依賴(lài)且與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的凋亡關(guān)聯(lián)基因-2(Apotosis-linked gene-2，alg-2)和死亡相關(guān)蛋白激酶2(

8、Deathassociated protein kinase，dapk2)在PND35上調(diào)，并在持續(xù)暴露組和出生前暴露組出現(xiàn)顯著性差異，表明PFOS造成的細(xì)胞凋亡升高與鈣信號(hào)通路受到干擾有關(guān)?？沟蛲龌駼cl-2在PND7和PND35均出現(xiàn)顯著性上調(diào)，且在出生前和出生后暴露組變化程度相當(dāng)。同時(shí)，BCL-2蛋白在PND35的出生后暴露組顯著下調(diào)，說(shuō)明PFOS引起凋亡升高后在轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制受損，且最終抗凋亡機(jī)制受到破壞。上述

9、研究結(jié)果表明PFOS能夠通過(guò)誘導(dǎo)[Ca2+]i升高，激活Ca2+關(guān)聯(lián)的凋亡相關(guān)基因，抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，最終造成海馬細(xì)胞的凋亡升高，這是PFOS造成神經(jīng)行為毒性的機(jī)制之一。
　　(5)研究出生前后PFOS暴露對(duì)關(guān)鍵鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的干擾，闡明其與PFOS神經(jīng)行為毒性之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示:PFOS暴露導(dǎo)致calpainⅠ的表達(dá)抑制和calpainⅡ的過(guò)度激活，引發(fā)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)紊亂。主要表現(xiàn)為環(huán)磷酸腺苷(cyclic aden

10、osinemonophosphate，cAMP)、蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP response element-binding protein，p-CREB)的表達(dá)抑制和鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinasesⅡ，CaMKⅡ)的過(guò)度激活，鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)和有