PFOS的肝臟和心臟發(fā)育毒性研究.pdf

1、PFOS 即全氟辛烷磺酸，是一種全球性的持續(xù)性有機(jī)污染物，可以通過食物鏈富集，誘導(dǎo)多種毒性效應(yīng)；且PFOS 可以通過胎盤屏障，對子代的生存、生長發(fā)育影響很大，所以對它的研究越來越多；近年來研究的熱點(diǎn)是它的肝毒性(肝腫大，肝細(xì)胞腺癌)和發(fā)育毒性(死亡率升高，生長發(fā)育遲緩)，因?yàn)镻FOS的這兩種毒性效應(yīng)比較顯著。
　　 但是，由于機(jī)體是由一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，所以此兩種毒性的機(jī)制尚不清楚，不同的研究報(bào)道的結(jié)果也不盡相同，如PPAR

2、α是否在肝毒性進(jìn)展中的具有重要性，或肺不張是否在出生后迅速死亡效應(yīng)中的關(guān)鍵因素。
　　 而近年來，由于表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)許多疾病特別是肝損傷或肝癌均與表觀遺傳改變相關(guān)，而發(fā)育毒性也與線粒體尤為相關(guān)。本論文以表觀遺傳毒性和線粒體損傷毒性為研究途徑，分別從肝臟細(xì)胞表觀遺傳效應(yīng)中的DNA 總甲基化和特異基因甲基化水平改變與否的角度出發(fā)，研究PFOS 肝毒性機(jī)制是否與其相關(guān)；另外，從心臟線粒體損傷及相關(guān)核酸、蛋白分子水平研究角度

3、出發(fā)，對PFOS的心臟發(fā)育毒性的可能機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 第一部分、胚胎期PFOS暴露對大鼠出生后斷乳期肝臟DNA總甲基化水平的影響
　　 目的：研究對大鼠出生前暴露于PFOS 與其出生后生長發(fā)育狀況和肝臟可能發(fā)生的DNA的甲基化修飾程度的改變之間的關(guān)系。方法：用陰道沖洗涂片法檢測受孕情況；在雌性SD大鼠受孕后的2-21天，對其進(jìn)行不同劑量PFOS(對照，0.1 mg/kg/d，0.6mg/kg/d,2.0 mg/kg/

4、d）灌胃染毒；記錄母鼠孕期生長速度和子鼠出生后的生存率和生長速度。子鼠出生后21天，即生長至斷乳期，收集血清和肝臟器官樣本。用HE染色觀測肝臟細(xì)胞正常與否；用液質(zhì)聯(lián)用法（LC/MS）檢測血清和肝臟中PFOS 含量；用總甲基化檢測試劑盒進(jìn)行DNA總甲基化水平的檢測；并用BSP 產(chǎn)物純化結(jié)合質(zhì)?？寺『鬁y序法檢測LINE-1的甲基化狀態(tài)；以及用AP-PCR 方法評估CpG 島的甲基化狀態(tài)；最后用定量PCR 檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA met

5、hyltransferase，DNMT)的表達(dá)情況。結(jié)果：母鼠孕期生長速度和子鼠出生后的生長速度在高劑量組均顯著性減慢（p＜0.05）；總甲基化水平在最高劑量組有顯著性降低（p＜0.05）；測序顯示LINE-1的甲基化水平各組間無顯著性差異（p>0.05）；AP-PCR 方法顯示各劑量組的CpG 島甲基化水平均與對照組有顯著性差異（p＜0.05）；另外，DNMT3a 在最高劑量組的表達(dá)水平有顯著性升高。結(jié)論：出生前暴露于PFOS 降低大

6、鼠出生后的生存率和減慢其生長發(fā)育速度；大鼠出生后21天肝臟總甲基化水平的降低也與出生前PFOS暴露水平相關(guān)，CpG 島甲基化水平降低也與出生前PFOS暴露水平相關(guān)。
　　 第二部分、胚胎期PFOS暴露引起出生后大鼠肝組織中個(gè)體基因甲基化狀態(tài)改變的研究
　　 目的：PFOS能夠引起一系列肝臟毒性和發(fā)育毒性，但目前機(jī)制尚不明確。本研究試圖論證DNA甲基化水平是否與PFOS 誘導(dǎo)的肝毒性早期過程相關(guān)；尤其是是否能發(fā)現(xiàn)相關(guān)的DN

7、A甲基化方面的生物標(biāo)志物，用于早期毒性的判斷。方法：在雌性SD大鼠受孕后的2-21天，對其進(jìn)行不同劑量PFOS(對照，0.1 mg/kg/d，0.6 mg/kg/d,2.0 mg/kg/d）灌胃染毒；在子鼠出生后21天，即斷乳時(shí)，收集肝臟組織樣本。用HE染色觀測肝臟細(xì)胞正常與否；用亞硫酸氫鈉測序PCR法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)，即BSP 產(chǎn)物純化結(jié)合質(zhì)粒克隆后測序法檢測GSTP(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi

8、)、p16等特定的可能為標(biāo)志性基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)；最后用定量PCR 檢測GSTP等基因的表達(dá)情況。結(jié)果：雖然顯微鏡下未見明顯的肝組織病理學(xué)(肝細(xì)胞腫大，空泡化等)改變，但GSTP的甲基化狀態(tài)在染毒組的斷乳期大鼠肝臟中發(fā)生了上升（高劑量組中，GSTP的啟動子的關(guān)鍵位點(diǎn)+79,81,84的甲基化水平改變高達(dá)30％，而對照組無甲基化發(fā)生），其CpG 島甲基化狀態(tài)與出生前PFOS暴露水平呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。然而GSTP的表達(dá)卻與其甲基化水

9、平不一致，后通過檢測調(diào)控GSTP的通路Keap1-Nrf2/MafK 發(fā)現(xiàn)，雖然GSTP的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2/MafK 并沒有發(fā)生量的變化，但是Nrf2的抑制因子Keap1的表達(dá)降低了，這可能間接導(dǎo)致了GSTP的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，GSTP的這種表達(dá)上調(diào)與機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)一致。結(jié)論：出生前暴露于PFOS使得出生后的大鼠肝臟中GSTP基因啟動子關(guān)鍵位點(diǎn)高甲基化，這種指標(biāo)比普通病理學(xué)觀察指標(biāo)更靈敏，且反映了潛在毒性的發(fā)展趨勢；雖然大鼠機(jī)體朝著

10、毒性效應(yīng)方向發(fā)展，但是短期內(nèi)卻是表現(xiàn)的氧化應(yīng)激，這點(diǎn)正好被GSTP 啟動子關(guān)鍵位點(diǎn)的高甲基化和GSTP的表達(dá)上調(diào)分別證實(shí)。
　　 第三部分、胚胎期PFOS暴露與出生后斷乳期大鼠心臟線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)功能改變的研究
　　 目的：大鼠出生前暴露于PFOS 對大鼠出生后的生長發(fā)育造成很大影響，達(dá)到劑量閾值之后，子鼠的死亡率明顯升高，生長發(fā)育也相對遲緩。而心臟是生長發(fā)育過程中的一個(gè)關(guān)鍵器官；線粒體是功能細(xì)胞器，在心肌細(xì)胞中起著重要作

11、用。本研究試圖探討心肌細(xì)胞線粒體微觀改變與這種發(fā)育毒性之間的相關(guān)性。方法：本實(shí)驗(yàn)中使用了電鏡切片觀察線粒體，表達(dá)譜芯片篩選線粒體功能相關(guān)基因，并用定量PCR和蛋白水平檢測進(jìn)行芯片結(jié)果的驗(yàn)證，以及用光學(xué)顯微鏡對傳統(tǒng)病理學(xué)和分子毒理學(xué)方面的可能性改變進(jìn)行觀察。結(jié)果：線粒體電鏡照片觀察到空泡化，內(nèi)膜溶解等現(xiàn)象；表達(dá)譜芯片結(jié)果篩選選出了部分與線粒體功能相關(guān)的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)超過1.5倍的基因，其中包括下調(diào)的線粒體內(nèi)膜構(gòu)成蛋白，ATP合成酶，ATP

12、消耗酶，和上調(diào)的線粒體保護(hù)蛋白Ucp系列基因等；通過定量PCR和蛋白水平的驗(yàn)證得到一致結(jié)果，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外在線粒體損傷的后續(xù)效應(yīng)觀察中，雖然心臟切片細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果無顯著差異；但PCNA 增殖及TUNEL 凋亡染色觀察結(jié)果在暴露組比對照組間有一定增加。結(jié)論：大鼠出生前暴露于PFOS 對大鼠出生后心臟線粒體造成損傷，雖然在心臟切片形態(tài)學(xué)觀察無顯著性改變，但是線粒體微觀觀察結(jié)果和功能相關(guān)基因的分子水平檢測發(fā)生了顯著性改變，與損傷