基于TAK1-MAPK及NF-κB信號通路粉防己堿干預肝纖維化及隱丹參酮改善暴發(fā)性肝衰竭作用機制研究.pdf

1、本研究采用大鼠肝星狀細胞T‐HSC/Cl‐6和D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)合誘導的小鼠暴發(fā)性肝衰竭動物模型，分別探討粉防己堿抗肝纖維化和隱丹參酮肝保護作用機制，從細胞凋亡轉(zhuǎn)導通路及TAK1‐MAPK家族信號轉(zhuǎn)導通路、NF‐κB信號通路等方面進行研究。
　?。?）粉防己堿為傳統(tǒng)中藥防己的活性生物堿成分，我們采用腫瘤壞死因子‐α(TNF‐α)‐刺激大鼠肝星狀細胞T‐HSC/Cl‐6，闡明粉防己堿抗肝纖維化作用機制。永生化大鼠肝星狀細胞T‐

2、HSC/Cl‐6給予不同濃度的粉防己堿孵育1小時后，處理未處理TNF‐α(10 ng/ml)并孵育不同時間。同時人正常肝細胞Chang liver給予不同濃度的粉防己堿孵育24小時。粉防己堿(0.39‐50μM)濃度和時間依賴性抑制T‐HSC/Cl‐6細胞生長率，然而濃度小于25μM時粉防己堿未對Chang liver細胞導致細胞毒性。粉防己堿濃度和時間依賴性抑制caspase‐3及其底物PARP裂解，并結(jié)合膜聯(lián)蛋白‐v和碘化丙啶作為熒

3、光探針的流式細胞方法確認25μM粉防己堿誘導T‐HSC/Cl‐6凋亡。同時，粉防己堿濃度和時間依賴性抑制α‐SMA蛋白表達。低濃度粉防己堿（6.25μM）未能誘導細胞凋亡并影響α‐SMA蛋白表達。25μM粉防己堿顯著上調(diào)JNK和ERK及其上游激酶TAK1磷酸化，并啟動NF‐κB P65核轉(zhuǎn)移與IκB‐α降解。另外，TNF‐α輕微抑制T‐HSC/Cl‐6細胞生長率，粉防己堿濃度大于12.5μM時對TNF‐α刺激T‐HSC/Cl‐6呈現(xiàn)細胞

4、毒性。TNF‐α刺激后T‐HSC/Cl‐6的α‐SMA和TRADD蛋白表達時間依賴性增高，而預處理6.25μM粉防己堿能顯著下降α‐SMA和TRADD蛋白表達。預處理6.25μM粉防己堿降低JNK和TAK1磷酸化以及NF‐κB p65核轉(zhuǎn)移與IκBα降解。由此可見粉防己堿抗肝纖維化機制至少可能涉及細胞凋亡依賴和非依賴途徑，由其濃度決定。高劑量粉防己堿基于活化NF‐κB和磷酸化TAK1/JNK/ERK誘導肝星狀細胞凋亡，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化；

5、低劑量粉防己堿抑制TNF‐α刺激肝星狀細胞的NF‐κB核轉(zhuǎn)移和TAK1/JNK磷酸化，從而抑制肝星狀細胞活化，可能經(jīng)細胞凋亡非依賴途徑。
　?。?）隱丹參酮為丹參的脂溶性活性成分，我們采用D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)合誘導的暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型探討隱丹參酮的肝保護作用機制。腹腔注射 D‐氨基半乳糖(700 mg/kg)/內(nèi)毒素(10μg/kg)12小時和1小時前，分別灌胃給予隱丹參酮(20或40 mg/kg)。D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素聯(lián)

6、合給藥后小鼠死亡率升高，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及TNF‐α水平也增高，給予隱丹參酮后上述指標顯著降低。隱丹參酮抑制caspase‐3、‐8和‐9活化，顯著改善D‐氨基半乳糖/內(nèi)毒素所致的肝細胞凋亡，并顯著降低細胞色素c從線粒體釋放到細胞質(zhì)。隱丹參酮顯著抑制 JNK、ERK和 p38磷酸化以及 TAK1磷酸化。此外，隱丹參酮顯著抑制 NF‐κB活化并下調(diào)促炎癥細胞因子的生成。綜上所述，隱丹參酮的肝保護分子機制可能與抗凋亡活性有關(guān)，