凡納濱對蝦血藍(lán)蛋白與副溶血弧菌相互作用蛋白的鑒定.pdf

1、對蝦養(yǎng)殖是我國重要的海產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)之一,但近年來隨著對蝦養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展,養(yǎng)殖過程中爆發(fā)的細(xì)菌性疾病和病毒性疾病給對蝦產(chǎn)業(yè)造成了巨大損失。為此,學(xué)者們認(rèn)為積極研究對蝦免疫機(jī)制,了解宿主與病原菌之間的相互作用關(guān)系,對尋找以防為主的生態(tài)學(xué)防治途徑,實(shí)現(xiàn)對蝦健康養(yǎng)殖等具有重要意義。有趣的是,包括本課題組在內(nèi)的研究表明對蝦血藍(lán)蛋白是一種具有多種免疫活性的多功能蛋白,且研究顯示其識別病原菌的作用靶位可能為外膜蛋白,但為何種外膜蛋白尚不清楚。為此,本

2、研究在此基礎(chǔ)之上,采取蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)策略對其進(jìn)一步研究,所獲研究結(jié)果如下:
　　首先,采用親和孵育的方法收集與對蝦血藍(lán)蛋白(用兔抗血藍(lán)蛋白73kDa亞基抗體親和純化所得血藍(lán)蛋白,命名為LH73)相結(jié)合的外膜蛋白(Outermembraneproteins,Omps),SDS-PAGE研究顯示,其包含分子量為35-45kDa的4種蛋白,分別命名為p1、p2、p3和p4,經(jīng)MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)p2和p3與副

3、溶血弧菌為OmpU和like-OmpC具有高度同源性,提示其可能為血藍(lán)蛋白與副溶血弧菌的相互作用蛋白。
　　在上述研究基礎(chǔ)之上,并結(jié)合課題組的前期報(bào)道,繼而采用基因克隆方法擴(kuò)增OmpU、like-OmpC和OmpW三種外膜蛋白,序列比對分析發(fā)現(xiàn)OmpW和like-OmpC為2條新序列,提交數(shù)據(jù)庫所獲登錄號為JX555977和JX555978。OmpW和like-OmpC全長分別為645、1050bp,編碼214、349個氨基酸。經(jīng)

4、BLAST比對,與其它弧菌對應(yīng)外膜蛋白序列分別有77-99％和60-99%的一致性,均具有典型的外膜蛋白結(jié)構(gòu)域,在進(jìn)化關(guān)系上與弧菌外膜蛋白同源。
　　最后,對這三種蛋白進(jìn)行原核表達(dá),并用Far-western-blotting分析純化的重組蛋白與LH73的相互作用。結(jié)果顯示,重組OmpU和like-OmpC確實(shí)能與LH73相互作用,與親和蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果一致,但OmpW不能與LH73相結(jié)合。說明,副溶血弧菌外膜蛋白OmpU和li