Tregs與Th17相關(guān)細(xì)胞因子在肌炎模型小鼠中表達(dá)的研究.pdf

1、特發(fā)性炎癥性肌病(IIM)是一組異質(zhì)性的急性、亞急性或慢性起病的罕見的獲得性骨骼肌炎性疾病。其臨床表現(xiàn)為肌肉無(wú)力,肌酸激酶升高,肌電圖非特異性異常等,常累及多臟器病變,病變嚴(yán)重時(shí)危及生命[1-3],目前其確切發(fā)病機(jī)制不清。根據(jù)臨床病理特征主要將其分為多發(fā)性肌炎(PM)、皮肌炎(DM)、包涵體肌炎(IBM)和免疫介導(dǎo)的壞死性肌炎(IMNM)。
　　由于多發(fā)性肌炎的發(fā)病機(jī)制不清,治療效果不理想,因此我們擬通過(guò)肌炎動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行研究。目

2、前較好的動(dòng)物模型是肌漿球蛋白誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎(EAM)模型,其在多個(gè)方面都與PM[4]相似,為我們研究IIM提供了良好的基礎(chǔ)。本研究中采用的模型為我們前期通過(guò)改變肌球蛋白注射劑量和注射輔劑的時(shí)間得到的改良EAM模型,其特點(diǎn)為用時(shí)短、重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠。我們前期的研究中觀察EAM模型2個(gè)月,發(fā)現(xiàn)炎癥逐步加重,在14天時(shí)炎癥最嚴(yán)重,然后炎癥稍有減弱,28天后基本成穩(wěn)定的炎癥狀態(tài),因此我們選擇0天、14天和28天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

3、。
　　大量的報(bào)道證實(shí),Tregs和Th17細(xì)胞之間的失衡與多種自身免疫性疾病有關(guān)[5-7]。Tregs是在自身免疫性疾病中的起保護(hù)作用的細(xì)胞,Th17細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)各種促炎反應(yīng)增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)的進(jìn)展。但這些研究都沒(méi)有闡明PM中,Tregs和Th17細(xì)胞之間到底如何變化?故本研究通過(guò)觀察Tregs和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子的變化情況,嘗試發(fā)現(xiàn)這些因子在肌炎發(fā)病過(guò)程中的可能作用。
　　目的
　　觀察Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Fox

4、p3及相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-6、IL-17、IL-23)在EAM發(fā)病過(guò)程中的變化規(guī)律,探討這些因子在肌炎中的可能作用以及這些因子與兩種細(xì)胞的相關(guān)性,從而嘗試找出調(diào)節(jié)兩種細(xì)胞變化的關(guān)鍵因子。
　　方法
　　將健康成年雌性BALB/c小鼠(體重15~18g,5~6周齡)隨機(jī)分為3組,每組5只:第一組為0天處理組(正常組),第二組為EAM14天處理組,第三組為EAM28天處理組。進(jìn)

5、行肌力測(cè)定和組織病理學(xué)評(píng)分;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠肌肉和脾臟中Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β)和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-6、IL-17、IL-23)mRNA的表達(dá)水平;采用Luminex液相芯片技術(shù)檢測(cè)小鼠血清中IL-6,IL-17和TGF-β1的表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.0天處理組小鼠肌力均超過(guò)30分鐘,EAM處理組小鼠肌力均明顯下降,以EAM14天處理組肌力下降最

6、明顯,三組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);組織病理學(xué)評(píng)分:0天處理組0分,EAM14天處理組3.05±0.190分,EAM28天處理組1.85±0.105分,在14天時(shí)炎癥最為嚴(yán)重,28天時(shí)略有好轉(zhuǎn)(P<0.01)。通過(guò)光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),0天處理組小鼠的肌纖維是多角形,大小基本一致,細(xì)胞核多位于肌纖維周邊,I型(深染)與II型(淺染)肌纖維清晰可見;EAM14天處理組小鼠的肌纖維大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肌纖維大小不等,可見散在分布的壞死、再生

7、纖維;EAM28天處理組小鼠的肌纖維炎癥程度稍減輕,但仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2.在小鼠肌肉組織的mRNA中,Tregs相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3在0天時(shí)表達(dá)較低(0.697±0.322),在14天時(shí)略有升高(1.274±0.547),在28天時(shí)顯著增加(16.491±7.884);IL-10在0天時(shí)表達(dá)較低(1.010±0.479),在14天時(shí)顯著增加(5.670±2.979),28天時(shí)下降(2.648±0.633);TG

8、F-β在0天時(shí)表達(dá)較高(0.576±0.250),在14天時(shí)有所下降(0.358±0.186),在28天時(shí)顯著降低(0.094±0.075)。Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17和IL-23變化規(guī)律從0→14→28天都為持續(xù)上升趨勢(shì),28天增高最為顯著(IL-6:0.459±0.308,0.636±0.113,1.477±0.224;IL-17:0.718±0.208,2.197±0.295,19.237±2.126;IL-23:

9、0.754±0.296,2.035±1.050,20.158±11.188)。
　　3.在小鼠脾臟組織的mRNA中,Tregs相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3從0→14→28天為持續(xù)增高,28天增高最顯著(0天:1.017±0.080;14天:1.908±0.675;28天:4.992±1.924)。相反,其相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10和TGF-β則均為下降趨勢(shì),14天時(shí)就下降顯著,28天繼續(xù)降低(IL-10:0.994±0.147,0.

10、223±0.057,0.183±0.043;TGF-β:0.697±0.188,0.063±0.104,0.063±0.058)。Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6在0天時(shí)表達(dá)較高(0.507±0.384),在14天時(shí)顯著下降(0.066±0.163),在28天時(shí)略有升高(0.167±0.069);IL-17在0天時(shí)表達(dá)較低(1.269±0.293),在14天時(shí)略有升高(2.681±0.305),在28天時(shí)顯著增加(10.252±1.672

11、);IL-23無(wú)明顯變化。
　　4.在小鼠血清中,IL-6,IL-17和TGF-β1的表達(dá)水平三者均為在0天時(shí)最低,14天時(shí)達(dá)到高峰,28天時(shí)有所下降,但仍高于0天,與肌肉組織的炎癥程度一致。(IL-6:0,35.840±3.094,3.740±1.108;IL-17:0,35.130±5.524,10.120±3.579;TGF-β1:2413.100±223.563,3861.600±317.621,2895.800±366.

12、154)。
　　結(jié)論
　　1.在EAM的發(fā)病過(guò)程中,Tregs的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及相關(guān)的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β和Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-23都有不同的顯著變化,總的趨勢(shì)為前者下降,后者增高,提示Tregs和Th17之間的失衡在肌炎發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
　　2.在肌炎的14天升高的細(xì)胞因子有IL-10和IL-17,說(shuō)明其在早期的炎癥反應(yīng)時(shí)發(fā)揮重要作用;在28天時(shí)仍升高的細(xì)胞因子有IL

13、-6、IL-17、IL-23,說(shuō)明這些細(xì)胞因子可能與炎癥的持續(xù)發(fā)展有關(guān)。
　　3.在肌炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,小鼠脾臟中的IL-6、IL-10和TGF-β逐步降低,提示脾臟作為T淋巴細(xì)胞的增殖場(chǎng)所,調(diào)控體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的分布,使T淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)再循環(huán)后重新分布,使這些因子向肌肉炎癥部位歸巢,從而發(fā)揮其免疫作用,說(shuō)明脾臟在肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。
　　4.在肌肉組織炎癥發(fā)展過(guò)程中,IL-6逐步上升,TGF-β逐步下降,在14天時(shí)