STAT3基因突變的常染色體顯性遺傳高IgE綜合征發(fā)病機制初探.pdf

1、第一部分高IgE綜合征的臨床特征、STAT3基因和Th17細胞分析
　　目的:探討高IgE綜合征患兒臨床特征，分析STAT3基因和外周血Th17細胞數(shù)量。
　　方法:總結9例NIH評分≥40分、臨床診斷高IgE綜合征患兒的臨床特征，用RT-PCR及DNA-PCR直接測序法，分析患兒及家系成員STAT3基因，運用流式細胞術檢測7例患兒外周血PBMC CD4+T細胞中Th17細胞數(shù)量。
　　結果:9例患兒均有濕疹、反復肺炎

2、、異常增高的血清IgE水平和嗜酸性粒細胞增高，NIH評分范圍為45～77分。5例患兒為STAT3基因熱點突變V637M或R382W/Q，2例患兒為位于SH2結構域的新型錯義突變T620S和R609G，另2例患兒未發(fā)現(xiàn)STAT3基因突變。與正常對照相比(0.40％-2.25％)，6例STAT3突變的患兒外周血CD4+T細胞中Th17細胞比例明顯下降或缺乏(0％～0.28％)(P＜0.05);而1例無STAT3突變的患兒Th17細胞數(shù)量在正

3、常范圍內，為0.53％。
　　結論:9例無親緣關系的高IgE綜合征患兒中，7例有STAT3基因雜合錯義突變，包括2種新型突變。并非所有NIH評分高于40分HIES患者都有STAT3基因突變，Th17減少者發(fā)生STAT3基因突變可能性大，更可能是AD-HIES。
　　第二部分STAT3基因新型突變T620S質粒構建和鑒定
　　目的:構建STAT3基因新型突變T620S真核表達載體，轉染至COS7細胞，為研究STAT3蛋白

4、及其突變蛋白功能打下基礎。
　　方法:根據(jù)Genbank中人STAT3mRNA序列(NM139276.2)設計含特定位點突變T620S的PCR引物，兩端分別引入限制性內切酶酶切位點。以野生型STAT3表達載體（pAcGFP1-N1-STAT3-WT）DNA為模板進行目的基因擴增，將目的基因亞克隆至T載體中，重組T載體經(jīng)雙酶切及測序鑒定正確后，雙酶切重組T載體和真核載體pAcGFP1-N1，回收目的片段，經(jīng)T4連接酶連接、轉化后，構

5、建真核表達載體pAcGFP1-N1-STAT3-T620S，進行雙酶切及測序鑒定。表達載體轉染COS7細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強度，流式細胞術檢測轉染效率。
　　結果:酶切、測序均表明pAcGFP1-N1-STAT3-T620S突變質粒構建成功，且在COS7細胞中觀察到綠色熒光表達，流式細胞術檢測轉染效率是47.02％。
　　結論:成功構建了STAT3新型突變T620S真核表達載體，并能在COS7細胞中瞬時表達，為研究

6、STAT3蛋白的功能奠定了基礎。
　　第三部分STAT3基因熱點區(qū)域突變對STAT3蛋白功能的影響
　　目的:探討AD-HIES相關STAT3熱點突變及新型(T620S)突變體分子活化、運動軌跡變化，及其在AD-HIES發(fā)病機制中的作用。
　　方法:將人STAT3野生型真核表達質粒WT-STAT3-GFP，突變質粒R382W-STAT3-GFP，V637M-STAT3-GFP和T620S-STAT3-GFP用脂質體20

7、00轉染至無內源性STAT3表達的COS7細胞，轉染質粒均設轉染劑對照組、空載體對照組、有刺激和無刺激組。轉染36小時后用EGF刺激(100ng/ml)20min，提取胞漿和胞核蛋白，Western blot檢測胞漿和胞核中各組間STAT3與磷酸化STAT3(pSTAT3)表達量，比較其差異;轉染24小時后加入EGF(100ng/ml)刺激，即用激光共聚焦顯微鏡在1小時內連續(xù)觀察STAT3的聚集及核轉位，比較各組間差異，同時在刺激后1小

8、時用DAPI染細胞核進行核定位，觀察STAT3分子在核內的聚集情況。
　　結果:從Western blot圖中觀察到，EGF刺激前后在轉染質粒的COS7細胞胞漿和胞核中野生型和三種突變質粒(R382W-STAT3-GFP，V637M-STAT3-GFP和T620S-STAT3-GFP)均有120KD的STAT3-GFP融合蛋白表達，但T620S表達較弱，且出現(xiàn)120KD、92KD兩個條帶。EGF刺激COS7細胞后，胞漿和胞核中pS

9、TAT3在轉染野生型和R382W均有較強表達，V637M表達較弱，而T620S突變幾乎無pSTAT3表達。從激光共聚焦顯微鏡觀察到，在EGF刺激后，WT-STAT3-GFP迅速形成聚集體并核轉位，1小時內可在核內看到明顯的聚集現(xiàn)象;其核輸出及降解過程大約從2.5小時開始，至7小時時基本結束。R382W-STAT3-GFP形成聚集體和核轉位的時間均晚于野生型，量也較少;而其核輸出過程在4小時內結束。V637M-STAT3-GFP僅在胞漿內

10、看到少量STAT3聚集體形成，1小時時在核膜周圍有少量聚集，核轉位不明顯。T620S-STAT3-GFP在1小時內幾乎無STAT3聚集。激光共聚焦顯微鏡與Western blot的pSTAT3結果基本一致。
　　結論:有STAT3磷酸化的R382W突變可見核轉位現(xiàn)象，STAT3磷酸化弱的V637M突變核轉位少，缺乏STAT3磷酸化的T620S突變無核轉位。STAT3 SH2結構域的V637M和T620S突變較DNA結合域的R382