神經(jīng)元EphA4介導的星形膠質(zhì)細胞ephrin-A3逆向通路激活對缺血后海馬損傷的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞間通訊在缺血后神經(jīng)血管單元的損傷和功能重建中所發(fā)揮的重要作用越來越受到重視。分別表達于神經(jīng)元的EphA4和表達于星形膠質(zhì)細胞的ephrin-A3在既往的研究中被認為可以通過星形膠質(zhì)細胞ephrin-A3逆向通路調(diào)節(jié)細胞外谷氨酸濃度進而影響樹突棘的形態(tài)和功能，此外，另有研究發(fā)現(xiàn)EphA4/ephrin-A3在缺血后的海馬組織出現(xiàn)顯著地表達上調(diào)，提示其參與海馬缺血后的病理生理過程。本研究旨在使用預聚集化

2、的EphA4激活ephrin-A3通路，觀察ephrin-A3逆向通路在海馬缺血后的病理生理過程中所扮演的角色及相關(guān)機制。
　　方法：
　　使用Pulsinelli四血管阻斷法建立全腦缺血再灌注模型，采用半定量RT-PCR觀察假手術(shù)組及缺血組在缺血后不同時間點EphA受體酪氨酸蛋白激酶及其配體ephrin-A mRNA變化的情況。免疫熒光雙標法觀察EphA4/ephrin-A3在海馬的定位。Western Blot法檢測Ep

3、hA4/epnrin-A3缺血后的表達改變。免疫共沉淀證實EphA4/epnrin-A3受體配體復合物形成。Nissle染色和TUNEL染色檢測預聚集化的EphA4激動ephrin-A3逆向通路后海馬神經(jīng)元壞死和凋亡情況。Morris水迷宮檢測海馬依賴性空間記憶。Western Blot法及谷氨酸檢測試劑盒檢測ephrin-A3逆向通路激活后星形膠質(zhì)細胞高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT1和GLAST表達變化及星形膠質(zhì)細胞谷氨酸攝取能力。

4、>　　結(jié)果：
　　半定量PCR結(jié)果表明，EphA1-A8及EphA10 RNA在正常的海馬組織均有表達，而EphA4,EphA5是正常海馬含量較為為豐富的EphA受體，表達量緊隨其后的是EphA1、EphA7及EphA8，而EphA2、EphA3、EphA6及EphA10則在正常海馬表達相對較低。而在缺血再灌注后，EphA1-A8及EphA10的RNA表達呈現(xiàn)出不同變化模式，其中EphA1、EphA2、EphA3、EphA6、Ep

5、hA7及EphA8的RNA表達在缺血再灌注后的6小時即開始出現(xiàn)上調(diào)，1天或3天表達到達頂峰后逐漸下降；而與此不同的是EphA4、EphA5和EphA10的表達自缺血再灌注后6小時開始直至第7天其mRNA水平始終保持上升趨勢。ephrinA1-A5在正常的海馬組織均有表達，ephrin-A3是正常海馬含量最為豐富的ephrin-A配體，其次是ephrin-A1和ephrin-A2，而ephrin-A5和ephrin-A4則表達相對較少。而

6、在缺血后，ephrinA1-A5均出現(xiàn)了短暫地表達上調(diào)，其中以ephrin-A3最為顯著，并且在缺血再灌注后的第一天RNA表達量達到頂峰，ephrin-A1，ephrin-A2，ephrin-A4，ephrin-A5也出現(xiàn)了不同程度的表達上調(diào)。免疫熒光雙標顯示EphA4主要分布于NeuN陽性神經(jīng)元，而ephrin-A3主要定位于GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞。Western Blot法顯示EphA4和epnrin-A3均出現(xiàn)缺血誘導性表達上調(diào)

7、，并都于缺血后1天表達到達峰值。此外，免疫共沉淀顯示EphA4及其高親和力配體間的相互作用隨著缺血誘導而增強。Nissle染色、TUNEL染色及Morris水迷宮檢測顯示缺血前30min側(cè)腦室注入預聚集化的EphA4激動ephrin-A3逆向通路，加重了缺血后的海馬神經(jīng)元損傷并損害海馬依賴性空間記憶。Western Blot法及谷氨酸濃度測定進一步證實ephrin-A3逆向通路激動下調(diào)了星形膠質(zhì)細胞高親和力谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT1和GLAS

8、T并明顯抑制了星形膠質(zhì)細胞的谷氨酸攝取能力。
　　結(jié)論：
　　EphA4/epnrin-A3作為海馬區(qū)表達最為豐富的EphA受體和ephrin-A配體分別主要表達于神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。在全腦缺血后EphA4/epnrin-A3均出現(xiàn)缺血誘導的一過性表達上調(diào)。預聚集化的EphA4激動星形膠質(zhì)細胞ephrin-A3逆向通路,導致星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT1和GLAST表達下調(diào)，抑制星形膠質(zhì)細胞的谷氨酸攝取能力，加重全腦缺血