肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后COX2表達(dá)上調(diào)機(jī)制及其抗凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、目的：明確肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后COX2表達(dá)上調(diào)的機(jī)制，并對其抗凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行初步探討。
　　方法：免疫組化法檢測 COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)并分析其相關(guān)性；轉(zhuǎn)染si-RNA抑制UPR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；RT-q-PCR法檢測COX2 mRNA的表達(dá)；TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；Annexin V+PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；Western blot法檢測COX2、CHOP、Bcl2、

2、Bax表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1．肝癌組織COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)情況及COX2與ATF6、IRE1、PERK的相關(guān)性分析
　　采用免疫組化法檢測 COX2、ATF6、IRE1、PERK的表達(dá)并分析其相關(guān)性，結(jié)果顯示：164例肝癌患者中，COX2陽性患者109例，陰性患者55例；ATF6陽性患者134例，陰性患者30例；IRE1陽性患者90例，陰性患者74例；PERK陽性患者91例，陰性73例

3、。COX2與ATF6的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.198，P=0.011）。
　　2． si-ATF6、si-IRE1、si-PERK轉(zhuǎn)染效率的檢測
　　使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后熒光強(qiáng)度，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后相關(guān)蛋白的表達(dá)，最終篩選出si-ATF6-2、si-IRE1-3和si-PERK-3三條同源序列具有較高的轉(zhuǎn)染效率，能分別有效抑制ATF6、IRE1、PERK蛋白的表達(dá)。
　　3．抑制UPR通路對ERS

4、后HepG2細(xì)胞COX2表達(dá)的影響
　　3.1、RT-q-PCR法檢測COX2 mRNA的表達(dá)變化
　　使用RT-qPCR法定量檢測COX2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果可見：TM組的COX2 mRNA表達(dá)相比空白組明顯增加（P＜0.01），應(yīng)用si-RNA抑制UPR通路后，TM+si-ATF6組COX2 mRNA表達(dá)較TM組和NC組顯著減少（P＜0.01），而TM+si-IRE1組、TM+si-PERK組的COX2 mRNA的表達(dá)

5、未見明顯變化。
　　3.2、Western blot法檢測COX2蛋白的表達(dá)變化
　　使用Western blot法檢測COX2蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果可見：TM組與空白組相比 COX2蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；TM+si-ATF6組 COX2蛋白表達(dá)相比TM組和NC組顯著減少（P＜0.01）。TM+si-IRE1組、TM+si-PERK組的COX2蛋白的表達(dá)未見明顯變化。
　　4．抑制ATF6表達(dá)對ERS后Hep

6、G2細(xì)胞凋亡的影響
　　4.1、TUNEL法觀察HepG2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變
　　使用TUNEL法從形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡，結(jié)果可見：空白對照組凋亡細(xì)胞百分比為：4.10±0.94％，TM組凋亡細(xì)胞百分比為：15.85±2.43%，TM+NC組凋亡細(xì)胞百分比為：17.42±2.15%；TM+si-ATF6組凋亡細(xì)胞百分比為：34.62±3.28%。TM+si-ATF6組的凋亡細(xì)胞百分比明顯高于TM組（P＜0.01）和空白對照組

7、（P＜0.01）。
　　4.2、FCM檢測HepG2細(xì)胞凋亡率
　　使用AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果可見：空白對照組細(xì)胞凋亡率為：4.97±0.34%，TM組凋亡率為：10.87±1.30%，TM+NC組凋亡率為：11.49±2.22%； TM+si-ATF6組凋亡率為：26.95±3.42%。TM+si-ATF6組的細(xì)胞凋亡率較空白對照組（P＜0.01）和TM組（P＜0.01）顯著增加。
　

8、　5.COX2表達(dá)上調(diào)抑制HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制探討
　　轉(zhuǎn)染si-ATF6抑制ERS后HepG2細(xì)胞的COX2表達(dá)，用Western blot法檢測CHOP、Bcl2、Bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：TM+si-ATF6組與空白對照組（P＜0.01）和TM組（P＜0.01）相比CHOP表達(dá)明顯增加，Bcl2/Bax比值顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：在ERS后的肝癌HepG2細(xì)胞中，ATF6通路的激活是COX2表達(dá)上調(diào)