玉米鹽誘導蛋白激酶基因ZmPti1、ZmSPK1和ZmASK1的克隆及功能分析.pdf

1、蛋白激酶在植物的抗鹽途徑中起到了非常重要的作用。我們以擬南芥和水稻的數(shù)據(jù)庫中參與鹽脅迫信號的蛋白激酶基因序列為信息探針，通過同源克隆的方法，從玉米中克隆了3個受鹽脅迫誘導的蛋白激酶基因，對這3個蛋白激酶的序列進行了分析，并對其在抗鹽途徑中的作用做了研究。 通過RT-PCR的方法從玉米中克隆到一個受高鹽誘導的全長cDNA，其編碼一個與Ptil同源的蛋白，命名為ZmPtil。在酵母中表達ZmPtil蛋白，蛋白經(jīng)過ProBond Re

2、sin進行純化，并對純化的蛋白進行自我磷酸化活性分析。磷酸化分析試驗表明ZmPtil蛋白具有磷酸化活性。半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示ZmPtil基因的表達可以被水楊酸(sA)、低溫、甘露醇和鹽所誘導，但是不被脫落酸(ABA)所誘導。另外，在玉米不同的組織器官中ZmPtil基因的表達模式也不同。這些結(jié)果表明ZmPtil編碼了一個新的Pti1-like激酶，并且可能同時參與了生物逆境和非生物逆境的信號傳導過程，同時也很有可能參與了植物發(fā)育

3、過程的調(diào)控。 為了進一步驗證ZmPtil的生物學功能，我們在擬南芥中過量表達了ZmPtil基因。隨后的分析結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系的抗病性和抗冷、抗旱性沒有明顯的提高，但是抗鹽性得到了明顯的提高。在高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生長狀態(tài)得到了改善；相對生物量、經(jīng)濟產(chǎn)量都得到了提高。生理生化分析表明，在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系相對于對照的SOD活性明顯提高；MDA含量和外滲電導率則顯著降低。 同樣通過RT-PCR的方法，一個被高

4、鹽誘導的全長的cDNA被克隆，命名為ZmSPK1(for stISSs-induced protein kinase)。序列分析表明，此cDNA編碼一個與SnRK2b同源的蛋白。生物信息學分析表明ZmSPK1蛋白含有364個氨基酸，估計分子量為41.8KD，等電點為5.8。 進化樹分析表明，推測的蛋白質(zhì)序列與SnRK2b組蛋白成員序列的一致性最高。在酵母中表達ZmSPK1蛋白，表達的蛋白經(jīng)過ProBond Resin純化后用來做磷酸化

5、活性分析，磷酸化分析結(jié)果表明ZmSPK1具有激酶活性。半定量RT-PCR分析表明ZmSPK1的表達可以被甘露醇、鹽和ABA所誘導。另外，在玉米不同組織器官中，ZmSPK1顯示不同的表達模式，在生殖器官中表達量最高。這些結(jié)果表明，ZmSPK1可以編碼一個有功能的蛋白激酶，可能在非生物脅迫中起到一定作用，同時也可能參與了植物的生殖發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。 在擬南芥中過量表達ZmSPKl基因發(fā)現(xiàn)，與對照相比，轉(zhuǎn)基因株系對鹽、干旱脅迫的抗性沒有

6、明顯提高。表明ZmSPKI可能不是抗鹽、抗旱途徑的主效基因，其在抗鹽途徑中所起的作用沒有達到足以影響到表型的程度。通過同樣的方法，從玉米根中克隆了一個受高鹽誘導的全長cDNA，此cDNA編碼一個與GSK-3/shaggy同源的蛋白，命名為ZmASKI(for abiotic stress-inducedk<,->inase )。生物信息學分析表明ZmASKI蛋白包含426個氨基酸，估計分子量為48.5KD，等電點為8.7。半定量RT-P