2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
   鼻咽癌是高發(fā)于中國南方的惡性腫瘤之一。生物學(xué)行為上,鼻咽癌較之頭頸部其它惡性腫瘤有更容易出現(xiàn)早期組織侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,因此預(yù)后較差。臨床上,常根據(jù)TNM分期來預(yù)測鼻咽癌患者的預(yù)后,但我們發(fā)現(xiàn),TNM分期相同的不同鼻咽癌患者,即使接受同樣的放療和化療方案,也常常表現(xiàn)出不同的臨床后果。那么,是否存在某種機(jī)制,參與鼻咽癌的發(fā)展演進(jìn)過程,從而影響其臨床預(yù)后?但目前研究尚未得到明確的結(jié)論。在病理組織形態(tài)上,鼻咽癌高發(fā)區(qū)的

2、主要組織學(xué)類型為未分化型非角化性癌,其特點(diǎn)是癌組織中常有較多淋巴類細(xì)胞浸潤,這種炎癥樣的微環(huán)境是鼻咽癌的一個(gè)顯著組織學(xué)特征。目前的研究表明,慢性炎癥的微環(huán)境不僅是腫瘤的始動(dòng)因素,還參與促進(jìn)了腫瘤的生長、腫瘤血管形成、侵襲和轉(zhuǎn)移。這些功能是通過腫瘤間質(zhì)細(xì)胞分泌的炎癥介質(zhì)而發(fā)揮作用的。已有文獻(xiàn)報(bào)道某些細(xì)胞因子和化學(xué)因子具有影響腫瘤進(jìn)展的潛能,提示這些分子(因子)對(duì)腫瘤預(yù)后發(fā)揮著重要作用。
   鼻咽癌組織中常有較多淋巴類細(xì)胞浸潤,而

3、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和IL-8均可由這些細(xì)胞分泌,癌細(xì)胞本身也可分泌這些細(xì)胞因子;鼻咽癌易早期侵襲轉(zhuǎn)移是否與這些因子有關(guān)?這是值得探討的問題。而在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤細(xì)胞之間同質(zhì)黏附力的下降和腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間異質(zhì)黏附力的增強(qiáng)有助于腫瘤脫離原發(fā)灶而發(fā)生遷移。因此細(xì)胞黏附分子的作用功不可沒。同時(shí),腫瘤血管的生成除了為腫瘤組織提供氧氣也營養(yǎng)成

4、分,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長之外,也有助于瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。
   MIF可由多種組織細(xì)胞分泌,傳統(tǒng)上認(rèn)為它是一種T淋巴細(xì)胞源性的細(xì)胞因子,而巨噬細(xì)胞則是MIF主要的靶細(xì)胞。以往對(duì)MIF的研究多集中于其在感染、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、損傷修復(fù)等過程中的作用,近十年來的研究提示多種腫瘤中MIF過表達(dá);MIF可能具有刺激腫瘤細(xì)胞增殖、分化以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的潛能,其機(jī)制可能是通過促進(jìn)腫瘤血管生成、參與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期的作用、抑制p53的活性、

5、參與腫瘤免疫等。
   作為已知的可能具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞因子MIF,在鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移中,發(fā)揮了何種作用,是否影響了其它細(xì)胞因子比如IL-8的分泌、參與癌組織腫瘤性血管生成、影響了細(xì)胞黏附分子E-cadherin(E-cad)和CD44v6的功能,而且其作用機(jī)制如何?據(jù)目前掌握的資料,國內(nèi)外關(guān)于鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中MIF與IL-8、E-cad、CD44v6的關(guān)系的研究并不多見。
   研究內(nèi)容

6、:
   本論文采用141例鼻咽癌高發(fā)區(qū)的未分化型非角化性鼻咽癌和分化型非角化性鼻咽癌組織標(biāo)本,制作組織芯片,利用組織芯片的大規(guī)模、高通量和標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn),進(jìn)行免疫組化染色,檢測細(xì)胞因子MIF和IL-8、細(xì)胞黏附分子E-cad(介導(dǎo)同質(zhì)黏附)和CD44v6(介導(dǎo)介質(zhì)黏附)蛋白表達(dá),以及通過CD34的表達(dá)檢測腫瘤內(nèi)微血管密度,分析這些侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因素與鼻咽癌組織各項(xiàng)臨床病理特征的關(guān)系、以及這些因素之間的關(guān)系,探討其作用機(jī)制。同時(shí),本

7、研究采用細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1和CNE-2,用重組人MIF細(xì)胞因子分別外源性刺激這兩株細(xì)胞,與未經(jīng)MIF刺激的細(xì)胞相比較,通過ELISA、免疫細(xì)胞化學(xué)方法和蛋白印跡等方法,檢測培養(yǎng)液上清中IL-8的濃度、E-cad和CD44v6蛋白的表達(dá)情況,研究MIF細(xì)胞因子和IL-8、E—cad、CD44v6蛋白表達(dá)之間的關(guān)系,探討MIF促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。并且,進(jìn)行MIF基因克隆及其真核表達(dá)載體pcDNA3.1-MIF的

8、構(gòu)建并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞,建立穩(wěn)定過表達(dá)MIF的鼻咽癌細(xì)胞系,用以后續(xù)研究。
   我們的目的是通過組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)的研究以及對(duì)患者生存預(yù)后的分析,明確MIF在鼻咽癌中的表達(dá)是否影響癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移行為以及通過何種機(jī)制進(jìn)行調(diào)控;在諸多與MIF因子相關(guān)的因素中,哪一個(gè)才是能夠真正評(píng)估鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。
   全文共分為三章:
   第一章MIF蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其意義
   目的:檢測MI

9、F蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá),及其與IL-8,E-cad,CD44v6蛋白表達(dá)、微血管密度及臨床病理特征的關(guān)系。
   方法:
   1.收集診斷明確未經(jīng)治療的鼻咽癌病例141例,活檢組織標(biāo)本均用福爾馬林固定、石蠟包埋組織并進(jìn)行組織切片和HE染色。
   2.組織蠟塊制作組織芯片,并進(jìn)行組織切片和HE染色。
   3.采用免疫組化方法,使用DAKO加強(qiáng)試劑盒(ChemMateTMEnvision+/HRP,

10、GK500705,DAKO),在組織芯片上檢測鼻咽癌組織中癌細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞MIF、IL-8、E-cad、CD44v6蛋白表達(dá),用CD34顯示血管生成情況。分析各蛋白之間及其與微血管密度、鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系。
   4.使用EB病毒探針原位雜交試劑盒(Epstein-Barr Virus Probe ISH Kit)在組織芯片上進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn),檢測鼻咽癌組織中EBERs的表達(dá)情況。
   結(jié)果:
   1.

11、組織芯片包括141例NPC組織,其中男性92例(65.25%),女性49例(34.75%),年齡范圍25—76歲,中位年齡51歲;腫瘤T分期T1-2有60例,T3—4有81例;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移103例,不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例:臨床分期早期(Ⅰ-Ⅱ期)47例,晚期(Ⅲ—Ⅳ期)94例;組織學(xué)類型中分化型非角化性癌(DNKC)19例,未分化型非角化性癌(UCNT)122例,無角化性癌。
   2.免疫組化表明:MIF蛋白陽性信號(hào)位于癌細(xì)胞和

12、部分淋巴細(xì)胞的胞漿,141例鼻咽癌組織中MIF蛋白高表達(dá)率為69.50%(98/141)。MIF蛋白表達(dá)與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性;與微血管密度、患者存活率有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性;與IL-8、E-cad、CD44v6蛋白表達(dá)均相關(guān)。
   3.免疫組化顯示:鼻咽癌組織IL-8蛋白表達(dá)與鼻咽癌組織學(xué)類型、患者存活率、微血管密度有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性;E-cad蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、患者存活有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。鼻咽癌組織微血管

13、密度與腫瘤大小、MIF、IL-8蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性?;颊叽婊盥逝c淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。
   4.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、E-cad蛋白表達(dá)、微血管密度分別與鼻咽癌患者預(yù)后有獨(dú)立的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。
   5.本組141例鼻咽癌組織原位雜交顯示EBERs表達(dá)陽性率為100%(141/141),陽性信號(hào)位于癌細(xì)胞胞核。
   結(jié)論:
   1.MIF在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中起一定作用,其作用可能與MIF對(duì)IL-

14、8、E-cad、CD44v6和腫瘤血管生成的影響有關(guān)。
   2.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、E-cad蛋白表達(dá)、微血管密度分別是鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。
   第二章外源性MIF刺激鼻咽癌細(xì)胞后IL-8、E-cad、CD44v6的表達(dá)變化
   目的:在細(xì)胞學(xué)中研究外源性MIF細(xì)胞因子對(duì)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
   方法:
   1.常規(guī)培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1和CNE-2。
   2.CNE-1和

15、CNE-2兩株細(xì)胞分別給予不同濃度的重組人MIF細(xì)胞因子(MIF終濃度分別為25,50,100ng/ml),刺激24小時(shí)和48小時(shí)后,分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中的IL-8濃度。
   3.分別收集經(jīng)終濃度為25ng/ml的MIF細(xì)胞因子刺激24小時(shí)后的CNE-1和CNE-2細(xì)胞,一方面行免疫細(xì)胞組化榆測E-cad和CD44v6蛋白的表達(dá),一方面提取細(xì)胞蛋白并進(jìn)行蛋白印跡檢測E-cad和CD44v6蛋

16、白的表達(dá)。
   4.兩株細(xì)胞均抽提DNA,進(jìn)行EB病毒W(wǎng)片段PCR擴(kuò)增。
   結(jié)果:
   1.外源性細(xì)胞因子MIF刺激后,CNE-1和CNE-2細(xì)胞株培養(yǎng)上清中IL-8濃度均明顯上升,且隨MIF濃度的增多而升高,MIF濃度為100ng/ml時(shí)CNE-1細(xì)胞株的IL-8分泌進(jìn)入平臺(tái)期,而MIF濃度為50ng/ml時(shí)CNE-2細(xì)胞株的IL-8分泌進(jìn)入平臺(tái)期。
   2.免疫細(xì)胞化學(xué)中,可見外源性MIF刺

17、激前CNE-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)時(shí),E-cad蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜,MIF刺激后細(xì)胞離散,E-cad表達(dá)降低且陽性信號(hào)位于細(xì)胞漿(胞內(nèi)化、異常表達(dá));外源性MIF刺激后,CNE-2細(xì)胞較常規(guī)培養(yǎng)時(shí)呈梭形變,且細(xì)胞的CD44v6蛋白表達(dá)增強(qiáng)。Western—blot結(jié)果也顯示,外源性MIF刺激后,CNE-1細(xì)胞E-cad蛋白表達(dá)明顯下降,CNE-2細(xì)胞CD44v6蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。
   3.PCR結(jié)果證實(shí):CNE-1和CNE-2均為EB病

18、毒感染陰性株。
   結(jié)論:
   1.MIF因子具有體外上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞IL-8和CD44v6蛋白表達(dá)的能力,并下調(diào)E—cad蛋白表達(dá),可能由此促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
   2.MIF上調(diào)IL-8、CD44v6和下調(diào)E-cad蛋白表達(dá)是EBV非依賴性的。
   3.MIF可能誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EMT)。
   第三章MIF基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞
 

19、  目的:建立MIF基因真核表達(dá)載體和穩(wěn)定性過表達(dá)MIF的鼻咽癌細(xì)胞。
   方法:
   1.MTF基因克隆及其真核表達(dá)載體PcDNA3.1-MIF的構(gòu)建
   應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1和CNE-2的cDNA片段;將上述PCR純化產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pcDNA3.1分別用EcoRI和BamHI雙酶切;連接載體與目的片段,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序。
   2.pcDNA3.1

20、-MIF重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE-1和CNE-2
   采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞,轉(zhuǎn)染第二天加入G418篩選抗性細(xì)胞,以后每3天更換培養(yǎng)基和G418,培養(yǎng)10—14天后,改用維持量G418繼續(xù)篩選,維持4周后,篩選陽性細(xì)胞克隆,進(jìn)行Western-blot檢測MIF蛋白的表達(dá)。
   結(jié)果:
   1.測序結(jié)果表明成功構(gòu)建pcDNA3.1-MIF重組質(zhì)粒。
  

21、 2.Western-blot表明pcDNA3.1-MIF重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CNE-2細(xì)胞的MIF蛋白表達(dá)水平高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的對(duì)照組細(xì)胞。成功建立穩(wěn)定過表達(dá)MIF的鼻咽癌細(xì)胞系。
   結(jié)論:
   pcDNA3.1-MIF重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞能有效地過表達(dá)MIF。
   全文小結(jié)
   MIF在鼻咽癌中可能通過上調(diào)IL-8的表達(dá)、促進(jìn)腫瘤血管生成以及影響細(xì)胞黏附分子的表達(dá),包括影響介

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