鼻咽癌中STING信號(hào)通路調(diào)控髓源性抑制細(xì)胞的分子機(jī)制及臨床意義研究.pdf

1、鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種高發(fā)于我國(guó)華南地區(qū)的惡性腫瘤，95％以上的NPC與EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相關(guān)。放化療為基礎(chǔ)的綜合治療是目前主流的治療方式，但局部進(jìn)展的NPC5年復(fù)發(fā)率在40％以上，復(fù)發(fā)難治、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NPC中位總生存時(shí)間不足1年。腫瘤免疫治療，因其低毒性和潛在的治愈性，成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。PD-1抗體、過(guò)繼性T細(xì)胞回輸?shù)让庖咧委?，已在NPC

2、顯示出初步的療效。然而，已有的免疫治療有效率偏低:腫瘤微環(huán)境中的抑制性細(xì)胞、負(fù)向調(diào)控分子，是腫瘤免疫逃逸及免疫治療失敗的重要原因。髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-deprived suppressor cells，MDSC)，是一種具有抑制功能的未成熟髓系細(xì)胞。MDSC在NPC大量擴(kuò)增、活化，抑制了殺傷性T細(xì)胞的功能，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　STING信號(hào)通路，是免疫系統(tǒng)識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中異常來(lái)源的雙鏈DNA，發(fā)揮天然免疫的重要通

3、路:皰疹病毒、結(jié)核分枝桿菌等病原體的DNA，進(jìn)入樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，該通路被激活，樹(shù)突細(xì)胞合成大量的Ⅰ型干擾素，促進(jìn)抗原呈遞、啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。近兩年的研究表明:來(lái)源于腫瘤的DNA，也可以激活STING信號(hào)通路，啟動(dòng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。
　　目的:
　　研究STING信號(hào)通路在NPC的活化狀態(tài)，探索該通路與MDSC分化的關(guān)系及臨床意義。
　　方法:
　　1.檢測(cè)STING信號(hào)通路的活化狀態(tài):利用免疫組化、ELSIA(

4、the enzyme-linkedimmunosorbent assay)、Westemblot等，檢測(cè)臨床樣本（腫瘤及癌旁組織、患者及健康人血清）和細(xì)胞系（癌細(xì)胞系、正常鼻咽上皮細(xì)胞系）中STING的表達(dá)、信號(hào)通路的活性。
　　2.分析STING信號(hào)通路影響MDSC的分化:利用過(guò)表達(dá)、siRNA沉默、磷酸化位點(diǎn)突變等技術(shù)手段以及癌細(xì)胞和CD33+細(xì)胞共培養(yǎng)體系，流式檢測(cè)分析STING信號(hào)通路對(duì)MDSC分化的影響。收集共培養(yǎng)體系上

5、清，ELISA測(cè)定IL-6、GM-CSF、IL-1β等細(xì)胞因子。
　　3.篩查調(diào)控STING的miRNA:結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，利用qPCR、Western Blot及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，篩查并驗(yàn)證NPC中調(diào)控STING的miRNA。
　　4.研究STING信號(hào)通路的臨床意義:收集臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析STING信號(hào)通路與MDSC水平、EB病毒DNA載量、分期、預(yù)后等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1.STING

6、信號(hào)通路在NPC中下調(diào):癌組織中的STING表達(dá)量顯著地低于配對(duì)的癌旁組織(n=22，p＜0.001)，患者血清中的STING濃度顯著地低于健康人(p=0.025)。癌細(xì)胞系（TW03、CNE2）中STING的表達(dá)量，低于正常鼻咽上皮細(xì)胞系(NP69); HSV-1刺激后，TW03、CNE2中p-TBK1、p-IRF3水平及IFN-βmRNA轉(zhuǎn)錄水平，低于NP69。
　　2.STING信號(hào)通路的下調(diào)促進(jìn)了MDSC的分化:相比于對(duì)照

7、組，過(guò)表達(dá)STING的TW03，誘導(dǎo)產(chǎn)生的MDSC數(shù)目明顯減少(p＜0.05)，對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制能力明顯減弱(p＜0.05);利用siRNA技術(shù)敲低TW03中的STING或?qū)TING磷酸化位點(diǎn)突變，誘導(dǎo)MDSC的結(jié)果正好相反?；颊吣[瘤組織中，STING與CD33的表達(dá)量，呈顯著的負(fù)相關(guān)(n=50，p＜0.001).
　　3.miR-24調(diào)控STING的表達(dá):生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，STING是miR-24的直接作用靶點(diǎn);TW03、CN

8、E2細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)miR-24，可下調(diào)STING mRNA的轉(zhuǎn)錄及STING蛋白的表達(dá);熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-24可直接結(jié)合STING3'UTR。
　　4.腫瘤組織中STING表達(dá)的臨床意義:患者腫瘤組織中STING的表達(dá)量，與血清中STING的濃度線性相關(guān)(n=50，r=0.5928，P＜0.0001)，與基線EB病毒DNA載量負(fù)相關(guān)(n=50，P=0.041)，與接受同步放療后的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間正相關(guān)(n=89，p=