劑量效應關(guān)系及肺癌細胞的部分功能狀態(tài)影響抗腫瘤藥物作用效果的研究.pdf

1、目的：
　　誘導分化為上個世紀70年代開始興起的腫瘤治療方法，最初應用于急性早幼粒白血病的治療，以后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)有誘導實體瘤分化的作用。就誘導分化而言，有的研究認為細胞周期阻滯在G0/G1期為誘導分化，也有研究認為阻滯在S期或G2/M期為誘導分化。
　　全反式維甲酸是脂溶性維生素A在體內(nèi)的衍生物，亞硒酸鈉是微量元素硒的氧化物鹽。研究表明它們能誘導分化白血病細胞HL-60、NB4及肝癌細胞SMMC-7721，并且可以誘導一些肺癌細

2、胞的增殖率、粘附力、侵襲力下降。非實體瘤的誘導分化主要集中在紅白血病和白血病上進行，實體瘤細胞對多種誘導分化劑可有程度不一的誘導反應?？杀环只T導的實體腫瘤有:惡性黑色素瘤、胃癌、淋巴瘤、肺腺癌及鱗癌、骨肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、肝癌、乳腺癌、星狀細胞瘤、絨毛膜上皮癌、膀胱癌、頭頸部癌、喉癌、前列腺癌及早期子宮頸癌等。
　　研究表明，不同腫瘤對誘導分化的反應性很不一致，就肺癌而言，腺癌、鱗癌可以被誘導分化，而小細胞肺癌僅有少數(shù)的幾例關(guān)于

3、誘導分化方面的報道。Li等人研究了全反式維甲酸和受體亞型選擇性維甲酸對人肺癌細胞生長和凋亡的影響，全反式維甲酸能抑制Calu-6和H460的生長，同時誘導RARβ表達，但它們對H292，SKMES-1和H661肺癌細胞系無作用，并且在這些細胞中RARβ沒有被誘導表達。
　　為尋找周期變化的規(guī)律，實驗選用A549細胞，以藥物全反式維甲酸、亞硒酸鈉研究劑量效應關(guān)系對藥物作用效果的影響。
　　實驗選用分化程度相異的A549、A2二

4、株細胞，以藥物全反式維甲酸、亞硒酸鈉來研究腫瘤分化程度對藥物作用效果的影響。
　　方法：
　　一、材料
　　肺腺癌細胞A549、肺囊性腺樣癌細胞A2購自中國醫(yī)科大學腫瘤研究所。全反式維甲酸、亞硒酸鈉是Sigma公司產(chǎn)品。Rb、c-myc鼠抗人單抗購自北京中杉公司。Sp-kit試劑盒、DAB液購自福州邁新公司。Western blot所用一抗（鼠抗人caspase3、p21、兔抗人RARα）購自北京中杉公司。羊抗鼠二抗購

5、自Sigma公司，羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司。引物采用primer3軟件設計:(1) Bcl-2(151bp)，(2) cycl inD3(230bp),(3) nm23(192bp),(4) Stat3(202bp),(5)β-act in(513bp)。由TaKaRa公司合成，提取總RNA的RNAout由深圳華氏生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，RT-PCR試劑盒及DNA聚合酶均購自TaKaRa公司，電泳用聚丙烯酰胺、Tris，甘氨

6、酸及瓊脂糖等購自上海生工公司。
　　A549、A2細胞接種于含10％胎牛血清、PH值7.0-7.2的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復傳代、培養(yǎng)至實驗所需數(shù)量。
　　全反式維甲酸溶于95％乙醇中配成10.0mmol/L貯存液，濾過除菌，-20℃保存，實驗前日用培養(yǎng)液稀釋至10倍所需濃度。亞硒酸鈉于實驗前日用雙蒸水配成10.0mmol/L，濾過除菌后用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度10倍。處理藥物全反式維甲

7、酸、亞硒酸鈉濃度依不同指標對細胞要求分別為:2.5μ mol/L、5.0μ mol/L、10.0μ mol/L、20.0μ mol/L、40.0μ mol/L。、80.0μ mol/L、160.0μ mol/L。薌藥物配制濃度一部分結(jié)合實驗所需，一部分結(jié)合臨床應用設計。
　　二、實驗方法
　　1、四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測吸光度并篩選濃度
　　計算每種藥物不同濃度的增殖抑制率。
　　腫瘤細胞增殖抑制率=（

8、對照孔平均OD值-實驗孔平均OD值)/對照孔平均OD值×100％
　　2、流式細胞儀檢測細胞周期變化及凋亡、壞死細胞比例
　　以流式細胞儀FACSCalibur，BD（美國）于FLA-2參數(shù)下檢測細胞周期，采集軟件Cell Quest3.0采樣，分析軟件ModFit LT3.0定量分析細胞周期各時期的百分率及凋亡、壞死細胞的百分率。
　　3、吖啶橙熒光染色觀察細胞凋亡及細胞形態(tài)變化
　　避光冷藏狀況下于熒光顯微鏡

9、下觀察并照相。激發(fā)熒光波長為450-490nm（綠熒光）。
　　4、倒置顯微鏡直接觀察細胞形態(tài)的變化
　　24小時后各孔于倒置顯微鏡下直接觀察并拍照。
　　5、 Giemsa染色觀察細胞形態(tài)變化
　　固定、染色、脫水、透明，中性樹膠封片后于400倍光鏡下觀察。
　　6、免疫組化SP法檢測癌基因、抑癌基因表達變化
　　免疫組化結(jié)果判斷標準連續(xù)計數(shù)1000個細胞陽性表達細胞數(shù)，以黃色或棕色染色為陽性。

10、r>　　7、羅丹明123熒光染色觀察細胞線粒體改變
　　避光冷藏狀況下于熒光顯微鏡下觀察并照相。激發(fā)熒光波長為450-490nm（綠熒光）。
　　8、電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變
　　固定、染色、切片，H-600A型透射電鏡下觀察并拍照。
　　9、Western Blot法于翻譯水平檢測基因蛋白的表達
　　用GIS-2020凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。
　　10、 Rt-PCR法于轉(zhuǎn)錄水平檢測基

11、因mRNA的表達
　　以β-actin吸光度值標化目的產(chǎn)物吸光度值，得到目的產(chǎn)物相對含量。
　　目的產(chǎn)物相對含量=強度（泳道1）/強度（泳道2）
　　抑癌基因上調(diào)比例=較對照上調(diào)抑癌基因例數(shù)/（較對照上調(diào)抑癌基因例數(shù)+較對照下調(diào)抑癌基因例數(shù)）×100％
　　癌基因下調(diào)比例=較對照下調(diào)癌基因例數(shù)/（較對照下調(diào)癌基因例數(shù)+較對照上調(diào)癌基因例數(shù)）×100％
　　11、數(shù)據(jù)處理
　　數(shù)據(jù)以（(x)±s）表示，

12、采用多因素方差分析:LSD法，Student-Newman-Keuls法（q檢驗）做多重比較。卡方檢驗:Kruskal-Wallis Test法，Median Test檢驗?；虿糠謱φ战M樣本均數(shù)采用T檢驗比較。SPSS14.0處理數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　藥物作用后，經(jīng)MTT檢測，處理組吸光度比對照組明顯降低，且呈現(xiàn)出濃度效應關(guān)系;經(jīng)流式細胞儀檢測，處理組凋亡細胞及壞死細胞碎片較對照組比例增加，且隨濃度增高而增多。隨濃度增加

13、，A549的二倍體細胞比例有所增加、異倍體細胞比例有所減少，A2（主要為多倍體）的異倍體細胞比例有所增加;倒置顯微鏡下觀察，處理組細胞折光度降低，細胞皺縮、破碎，邊緣不整;A2細胞集落化現(xiàn)象消失，形態(tài)由均一大小的小梭形變?yōu)槎喾N形態(tài)。Giemsa染色顯示A549細胞較對照組染色加深、分裂細胞減少、不對稱核分裂減少、細胞多形性減少;A2細胞較對照組體積增大、分裂細胞減少、梭形細胞增多、出現(xiàn)大量的多核巨細胞，集落化現(xiàn)象消失。經(jīng)吖啶橙熒光染色觀

14、察，隨藥物作用時間增加，A549處理組出現(xiàn)凋亡細胞。經(jīng)羅丹明123熒光染色觀察，A549、A2處理組線粒體熒光減少、強度降低，部分熒光顆粒變粗大。藥物作用后，A549、A2細胞在癌基因c-myc、抑癌基因Rb的表達上均與對照存在差異。c-myc的表達下降，A549細胞的Rb表達增高、A2細胞的Rb表達降低。經(jīng)電子顯微鏡觀察，處理組細胞線粒體腫脹、變圓、線粒體嵴模糊不清至線粒體空泡化改變、細胞表面絨毛脫落、核質(zhì)濃縮、出現(xiàn)凋亡和破碎細胞;免