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1、鎘是一種廣泛存在的環(huán)境污染物,1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將其列為確切的人類致癌物(IA).有關(guān)鎘的致癌作用,近年來在分子水平上展開了廣泛的研究,涉及到DNA損傷、基因調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等方面.越來越多的實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)氧化損傷是鎘引起癌變和細(xì)胞毒性的一個重要機(jī)制.當(dāng)給予Vit-C、Vit-E、GSH或GSH-Px等抗氧化劑,可有效拮抗鎘的致癌作用和細(xì)胞毒性.基于已有研究結(jié)果,推測在一定條件下,如果增加正常細(xì)胞中GST
2、-Pi的水平,有可能在對抗和消除鎘的致癌和細(xì)胞毒性中起重要作用.該研究第二部分的工作是從細(xì)胞水平探討轉(zhuǎn)導(dǎo)并表達(dá)GST-Pi基因后對鎘抑制細(xì)胞增殖作用的影響,為深入了解GST-Pi在腫瘤預(yù)防中的作用提供參考.研究方法:一、hGSTs GSTM1、T1、P1多態(tài)性基因型檢測與驗(yàn)證 1、GSTM1、T1、P1多態(tài)性基因型的檢測:隨機(jī)抽取該課題組其它分題用PCR-RFLP技術(shù)檢測過的樣本提取基因組DNA,用雙重PCR判定GSTM1、T1是否為缺
3、失基因型;常規(guī)PCR擴(kuò)增GSTP1基因,將檢測結(jié)果與先前檢測結(jié)果進(jìn)行比較,同時選擇GSTM1、GSTT1非缺失基因型和GSTP1樣本用于T載體克隆及測序.2、T載體克隆及鑒定:目的基因與T載體連接后,轉(zhuǎn)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α擴(kuò)增、提純質(zhì)粒.以質(zhì)粒DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增和限制性酶切鑒定T載體克隆是否成功.3、測序:將含有目的片段的質(zhì)粒DNA雙向測序,以鑒定目的片段是否插入T載體及確定其基因型.4、兩種方法學(xué)檢測結(jié)果比較:將該研究用P
4、CR擴(kuò)增及T載體克隆、測序方法檢測結(jié)果與該課題組用PCR-RFLP檢測方法所得結(jié)果相比較,了解該課題組建立的基因多態(tài)性檢測反應(yīng)體系的準(zhǔn)確性、可靠性及可重復(fù)性.二、GSTPi對鎘細(xì)胞毒性影響的買驗(yàn)研究 1、鎘對NIH3T3細(xì)胞生長抑制作用研究:選擇NIH3T3細(xì)胞給予0.1625μmo1·L<'-1>~80μmol·L<'-1>的氯化鎘,采用噻唑蘭(MTT)顏色反應(yīng)法檢測6~24hrs的細(xì)胞增殖功能,了解鎘對NIH3T3細(xì)胞生長抑制作用的
5、劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系,為進(jìn)一步研究鎘對GSTPi表達(dá)的NIH3T3-Pi細(xì)胞生長抑制作用尋找染毒劑量等依據(jù).2、GSTPi cDNA綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體構(gòu)建:提取人鼻咽癌細(xì)胞CNE1、CNE2總RNA,通過逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增GSTPi基因cDNA全序列,經(jīng)T載體克隆后利用基因重組技術(shù)將該基因序列插入綠色熒光蛋白表達(dá)載體,構(gòu)建GSTPi cDNA綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體,用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞.3、GSTPi表達(dá)細(xì)胞建立:應(yīng)用
6、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法將GSTPi cDNA表達(dá)載體導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞,獲得GSTPi表達(dá)細(xì)胞.經(jīng)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞、免疫組化檢測GSTPi表達(dá)情況.4、GSTPi對鎘細(xì)胞毒性影響的研究:GSTPi表達(dá)細(xì)胞NIH3T3-Pi和GSTPi低表達(dá)細(xì)胞NIH3T3-N1給予0.1625μmol·L<'-1>~10μmol·L<'-1>鎘染毒,采用噻唑蘭(MTT)顏色反應(yīng)法檢測6hrs、12hrs的細(xì)胞增殖功能,了解鎘對GSTPi表達(dá)細(xì)胞生長抑
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