生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸制備天然2-苯乙醇研究.pdf

1、2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE),又名β-苯乙醇、2-苯基乙醇,具有玫瑰花特有的香氣,天然存在于一些花和植物的精油中。2-苯乙醇香氣輕柔甜和,廣泛應(yīng)用于食品、日用化妝品和煙草行業(yè)。目前全球2-苯乙醇的年產(chǎn)量超過萬噸,主要通過化學(xué)合成生產(chǎn),僅有很少一部分是從玫瑰精油中提取得來的。生物技術(shù)的迅猛發(fā)展為2.苯乙醇的制備提供了新途徑。研究發(fā)現(xiàn)某些微生物在利用L-苯丙氨酸時(shí)會(huì)積累較高濃度的2.苯乙醇。L-苯丙氨酸(L-phe

2、nylalanine,L-Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸,工業(yè)上以發(fā)酵法或酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。根據(jù)美國(guó)及歐洲法規(guī),只要原料是天然的,通過生物技術(shù)處理后得到的產(chǎn)品也可以被認(rèn)為是天然的。因此,生物法制備天然2-苯乙醇將成為一種極具前途的生產(chǎn)路線。本文以L-苯丙氨酸為底物,研究了通過微生物轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)天然2-苯乙醇的方法。
　　 本文首先確定了底物L(fēng)-苯丙氨酸和產(chǎn)物2-苯乙醇的檢測(cè)方法。L-苯丙氨酸采用HPLC法檢測(cè)。Agilent11

3、00 series高效液相色譜儀配置了可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(VWD),KR100-5 C18柱(4.6mm×150mm×5μm)。流動(dòng)相為70:30(v/v)的甲醇和水,流速為0.5mL/min,柱子恒溫30℃,于260nm檢測(cè)物質(zhì)的吸收峰。2-苯乙醇采用GC法檢測(cè)。Varian CP3380氣相色譜儀使用甲基酮毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm),于160℃恒溫保持8min,進(jìn)樣器和FID檢測(cè)器均為280℃。
　　 從

4、土樣出發(fā),篩選2-苯乙醇的生產(chǎn)菌株。從多株能生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸的菌株中挑選到一株轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)的菌株,命名為P-3。與已經(jīng)報(bào)道的2-苯乙醇生產(chǎn)菌株相比,P-3轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸的能力較為突出,2-苯乙醇濃度較高,有工業(yè)化應(yīng)用前景。綜合菌株P(guān)-3的形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析和18s rDNA序列比對(duì)結(jié)果,確定菌株P(guān)-3為釀酒酵母,并將其命名為Saccharomyces cerevisiae P-3。該菌株已于2009年3月1日保藏于中國(guó)典型培

5、養(yǎng)物保藏中心,其保藏編號(hào)為CCTCC M209035。
　　 為提高2-苯乙醇產(chǎn)量,對(duì)生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)2-苯乙醇的培養(yǎng)基組成成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,最終確定了最佳生物轉(zhuǎn)化條件,即轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為L(zhǎng)苯丙氨酸7g/L,甜菜糖蜜50g/L,磷酸氫二鉀0.5g/L,磷酸二氫鉀0.75g/L。培養(yǎng)溫度為35℃,裝液量為50mL/1000mL三角瓶,于180 r/min的往復(fù)式搖床培養(yǎng)。在此條件下,2-苯乙醇的最高產(chǎn)量為3.97g

6、/L,摩爾轉(zhuǎn)化率為76.7％。在50 L發(fā)酵罐規(guī)模,24 h時(shí)2-苯乙醇的產(chǎn)量達(dá)到4.45g/L。初步嘗試了生物轉(zhuǎn)化液中的2-苯乙醇提取方法,得到了2.苯乙醇小樣,純度達(dá)到99.7%,符合FCC標(biāo)準(zhǔn),評(píng)香認(rèn)為香氣較好。
　　 為降低2-苯乙醇對(duì)細(xì)胞的毒性,嘗試了原位產(chǎn)物分離生物轉(zhuǎn)化。在使用有機(jī)溶劑作為萃取劑的生物轉(zhuǎn)化過程中,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道以及化合物的Log P值,挑選了油酸、油醇、十四酸異丙酯、十六酸異丙酯和聚丙二醇1500作為受

7、試溶劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)十四酸異丙酯、十六酸異丙酯和聚丙二醇1500效果較好,2-苯乙醇的產(chǎn)量有大幅提高。使用聚丙二醇1500作為萃取劑的50 L發(fā)酵罐轉(zhuǎn)化中,溶劑中2-苯乙醇濃度達(dá)到22 g/L,2-苯乙醇的總濃度達(dá)到7.5g/L。
　　 在使用大孔吸附樹脂的生物轉(zhuǎn)化過程中,篩選發(fā)現(xiàn)樹脂HZ818對(duì)2-苯乙醇有最強(qiáng)的選擇性吸附能力,而對(duì)L-苯丙氨酸的吸附能力較弱。轉(zhuǎn)化過程中加入7%的HZ818樹脂(w/v,干重),轉(zhuǎn)化40 h后最終2