致仔豬腦膜炎新型豬鏈球菌的鑒定.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）導致患病豬的腦膜炎，敗血癥以及各種化膿性炎癥，是引起公共衛(wèi)生危害的重要病原之一。按照莢膜抗原的血清學分類，目前共有35個豬鏈球菌的血清型。此外還存在不能定型或者不屬于現(xiàn)有血清型的菌株。
　　1. 仔豬腦膜炎新型豬鏈球菌分離株的鑒定和毒力分析
　　2013年3月至5月，江蘇某豬場大量斷奶仔豬患病死亡。發(fā)病率達35％，死亡率為90％?；疾游锉憩F(xiàn)出共濟失調(diào)、轉圈、頭部

2、震顫等明顯的腦膜炎癥狀。剖檢9只瀕臨死亡的病豬發(fā)現(xiàn)，腦部均有不同程度的水腫和點狀出血。從仔豬腦組織中分離培養(yǎng)獲得一株細菌，命名為CZ130302。通過生化鑒定，結合16S rRNA基因和谷氨酸脫氫酶基因(gdh)的測序鑒定，確定該細菌(CZ130302)為豬鏈球菌。電鏡觀察CZ130302株有莢膜結構，與參考血清的凝集試驗和多重PCR分型鑒定方法進一步確定該分離株不屬于現(xiàn)有的任一血清型。制備豬鏈球菌CZ130302菌株的高免血清。該血清

3、與現(xiàn)有的35個血清型菌株進行凝集反應試驗，結果均為陰性。150只BALB/c小鼠隨機分為15組，測定CZ130302的半數(shù)致死量(LD50)為2.89×106 CFU/只。對照豬鏈球菌2型毒力株P1/7的致死率為1/10，HA9801的致死率為2/10。攻毒試驗接種2×107CFU/只，結果顯示CZ130302的致死率為8/10，感染小鼠出現(xiàn)共濟失調(diào)，轉圈以及抽搐，小鼠剖檢癥狀與病豬的癥狀吻合，剖檢取病鼠的腦組織制作組織切片，發(fā)現(xiàn)腦部細

4、胞出現(xiàn)典型的細菌性腦膜炎的病理特征，表現(xiàn)為大量中性粒細胞的浸潤，膠質細胞噬神經(jīng)原現(xiàn)象以及大量神經(jīng)細胞的固縮和液化。人喉癌上皮（HEp-2）細胞粘附試驗發(fā)現(xiàn)CZ130302的定植力與強毒株HA9801定植力相當，低于歐洲經(jīng)典毒力株(1×107 CFU/well);小鼠腦內(nèi)皮(bEnd.3)細胞的粘附試驗中，CZ130302菌株則與HA9801和P1/7相一致(p＜0.01)。對CZ130302的毒力因子檢測結果表明該新型菌株的毒力基因型為

5、gdh+/orf2+/purD+/gene+/DltA+/PgdA+/Sortase A+/SspA+，不同于HA9801的毒力表型特征mrp+/epf+/sly+。
　　2. CZ130302株莢膜合成相關基因分析及PCR定型方法的建立
　　CZ130302菌株全基因組測序并補洞和拼接，結果證實該菌株在進化樹中處于獨立的分支中，既不屬于29個豬鏈球菌血清型分支，也不屬于建議被排除在豬鏈球菌以外的32、34以及20、22、2

6、6、33血清型。
　　通過莢膜合成相關基因序列的比對和分析發(fā)現(xiàn)，CZ130302株完整的莢膜基因組與現(xiàn)公布的豬鏈球菌不同血清型的莢膜基因組結構相似，莢膜合成途徑依賴于Wzy/wzx的轉運途徑。CZ130302菌株的莢膜基因組的開放閱讀框(orf)和蛋白質同源組(HGs)的注釋和命名暫定為“Chz”的注釋和命名，Chz-A至Chz-G的序列同源性較高，都在90％以上，在其他血清型的CPS比對中也較為統(tǒng)一;Chz-G至Chz-J區(qū)間差

7、異性較大，一般都在50％左右;Chz-J至Chz-P具有典型的型特異性。共發(fā)現(xiàn)23個HGs和4個未知的HGs，包括多糖合成酶(Wzy Polysaccharide polymerase)基因、翻轉酶（Wzx flippase）基因、糖基轉移酶(glycosyl transferase)基因以及乙酰基轉移酶(acetyltransferase)基因等莢膜代謝途徑看家基因。與現(xiàn)有的豬鏈球菌血清型進化樹分析發(fā)現(xiàn)，CZ130302菌株的以上4個

8、看家基因處在獨立的分支中，與豬鏈球菌的其他血清型的進化關系相似。
　　選擇Wzy/wzx的看家基因，作為PCR定型的基因設計Chz-M和Chz-O擴增引物，在已經(jīng)建立的多重PCR分型體系中與參考血清型的菌株反應，發(fā)現(xiàn)Chz-M基因引物與其他參考株無交叉反應。凝集試驗和Chz-M定型引物檢測實驗室保存的64株未能定型臨床分離株，篩選出三株該血清型的臨床分離株，分別為AH681(安徽，2006)，HN136（河南，2007），CZ11

9、09（江蘇，2011），血清凝集試驗結果發(fā)現(xiàn)AH681株反應結果為陰性，其余兩株為陽性反應結果。電鏡檢測AH681菌株無莢膜結構。測定CZ130302、AH681、HN136新型細菌的半數(shù)致死量(LD50)，結果顯示CZ1109的LD50為2.433×106 CFU/只，接近于CZ130302的半數(shù)致死量。而AH681和HN136無法檢測出LD50。
　　對豬鏈球菌的7個看家基因(dpr、mutS、cpn60、thrA、recA、

10、aroA、gki) PCR擴增后測序，建立多位點序列分型(MLST)圖譜，結果顯示CZ130302以及CZ110902屬于ST-383型，不屬于臨床分離的敗血癥致病株ST-1型。無莢膜的菌株AH681屬于ST-475型，也不屬于其他的ST型;HN136屬于ST-264型。
　　綜上，從罹患腦膜炎的仔豬腦組織中分離得到豬鏈球菌CZ130302，感染BALB/c小鼠后復制出相同的腦膜炎癥狀，為一株新血清型的豬鏈球菌。該菌株的莢膜多糖基