表皮生長因子受體在豬鏈球菌2型致腦膜炎過程中的作用及機制研究.pdf

1、豬鏈球菌二型(Streptococcus suis serotype2)是一種重要的人獸共患病病原菌，對人或者動物均具有高致病率并導致高死亡率。腦膜炎是SS2感染導致的重要臨床癥狀，但是SS2感染致腦膜炎特有的分子機制仍然有待研究。本研究主要探究EGFR在SS2菌株SC19致腦膜炎的過程中，介導神經(jīng)炎癥反應以及破壞細胞骨架的作用。主要結(jié)果如下:
　　1.SS2菌株SC19介導嚴重的神經(jīng)炎癥反應
　　SS2菌株SC19感染hB

2、MEC，隨著互作時間的延長，SC19黏附hBMEC的菌量顯著上升。SC19感染CD1小鼠，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)腦膜增厚、出血，腦組織出現(xiàn)炎性細胞浸潤以及噬神經(jīng)元的病理變化。CD1小鼠在感染SC19后，多種細胞因子和趨化因子發(fā)生顯著上調(diào)。同時，SC19感染hBMEC后炎性因子的轉(zhuǎn)錄也均有顯著上調(diào)。
　　2.SC19刺激hBMEC導致胞內(nèi)蛋白酪氨酸磷酸化
　　隨后采用SC19感染hBMEC，檢測細胞內(nèi)蛋白分子的酪氨酸磷酸化，發(fā)現(xiàn)在180，1

3、00，和60kDa的位置均有蛋白發(fā)生明顯的酪氨酸磷酸化。并證實180kDa大小的蛋白為EGFR。
　　3.SC19感染介導配體依賴性的EGFR激活與二聚體化
　　SC19感染hBMEC后，檢測ErbB家族（EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4）蛋白轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平，發(fā)現(xiàn)EGFR、ErbB2和ErbB4的轉(zhuǎn)錄水平不變，而ErbB3的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，翻譯水平與轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果一致。同時，通過免疫共沉淀和shRNA技術(shù)

4、分析發(fā)現(xiàn)，EGFR和ErbB3在SC19感染后發(fā)生酪氨酸磷酸化，并且介導EGFR和ErbB3形成異源二聚體。
　　進一步比較活菌和熱滅活的SC19感染hBMEC后EGFR的激活情況，發(fā)現(xiàn)活菌刺激激活EGFR，而在熱滅活菌株刺激下EGFR不發(fā)生酪氨酸磷酸化。同時，SC19活菌感染能夠上調(diào)EGFR的配體分子AREG、EREG和HB-EGF，而熱滅活SC19刺激并不能上調(diào)上述配體的轉(zhuǎn)錄。并且，采用MMPs抑制劑抑制EGFR配體的剪切釋放

5、后發(fā)現(xiàn)，EGFR的激活隨著抑制劑濃度的增高而減弱，表明SC19感染hBMEC介導配體依賴性EGFR的激活。
　　4.體內(nèi)體外實驗表明抑制EGFR的激活不影響細菌的黏附與定殖
　　為探究EGFR激活在SC19介導腦膜炎過程中的作用，我們隨后采用EGFR的抑制劑AG1478進行預處理，并發(fā)現(xiàn)AG1478處理并不能減少SC19對hBMEC的黏附。同樣，在SC19感染CD1小鼠時，比較AG1478給藥組和不給藥組的小鼠血液、腦組織和

6、肺組織的細菌定殖量，并未發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出顯著差別。
　　5.EGFR的激活參與SC19感染導致的神經(jīng)炎癥反應
　　隨后，我們分析了AG1478處理對于SC19感染誘導神經(jīng)炎癥的影響。體外，我們發(fā)現(xiàn)AG1478處理能顯著降低IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-2以及GRO-α的轉(zhuǎn)錄。同樣，體內(nèi)在抑制EGFR的激活后，循環(huán)血液中炎性因子的表達沒有明顯改變，但在腦組織中細胞因子的表達量顯著降低。
　　6.EGFR通過MAPK-

7、ERK1/2和NF-κB通路引起神經(jīng)炎癥反應
　　使用NF-κB和MAPK-ERK1/2通路抑制劑處理hBMEC后發(fā)現(xiàn)，SC19感染誘導的IL-6和MCP-1轉(zhuǎn)錄顯著被抑制。同時我們發(fā)現(xiàn)p65和ERK1/2在SC19感染后發(fā)生磷酸化，且感染前使用AG1478處理能顯著降低p65和ERK1/2的磷酸化。此外，免疫熒光發(fā)現(xiàn)p65在hBMEC感染后明顯入核，證實SC19感染后的確激活NF-κB通路，同時NF-κB通路的激活與MAPK-E

8、RK1/2的激活無關(guān)。上述結(jié)果表明，SC19感染hBMEC介導EGFR激活后，通過MAPK-ERK1/2和NF-κB通路引起神經(jīng)炎癥反應。
　　7.EGFR競爭結(jié)合ACTN4繼而影響細胞骨架的穩(wěn)定
　　隨后，通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，EGFR發(fā)生酪氨酸磷酸化的同時，其與ACTN4的結(jié)合有所增加。此外，ACTN4隨感染也能發(fā)生酪氨酸磷酸化，并且在感染前，ACTN4主要與actin結(jié)合來維持細胞骨架的穩(wěn)定;而在感染后，ACTN4被

9、EGFR競爭結(jié)合，導致與actin的結(jié)合明顯減少，繼而影響了細胞骨架的穩(wěn)定。
　　綜上所述，SS2菌株SC19感染hBMEC過程中，通過上調(diào)EGFR的相關(guān)配體分子AREG、EREG和HB-EGF，來介導EGFR的激活及EGFR/ErbB3異源二聚體的形成。EGFR的激活通過MAPK-ERK1/2和NF-κB通路引起hBMEC或腦組織中細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，導致神經(jīng)炎癥反應。此外，SC19刺激EGFR激活后還能競爭性的結(jié)合ACT