排石沖劑對(duì)腎結(jié)石大鼠腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及occludin、ZO-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　尿路結(jié)石為臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，積極尋求一種安全且療效確切的防治結(jié)石新療法，一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問(wèn)題。排石沖劑治療尿路結(jié)石有三十多年的歷史，臨床研究表明具有抗炎效果，有效率達(dá)86％。草酸鈣（CaOx）是尿路結(jié)石的主要成分，CaOx晶體誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激（OS）和炎癥損傷是尿路結(jié)石形成的關(guān)鍵，本研究以CaOx結(jié)石大鼠及離體NRK52E細(xì)胞為模型，觀察草酸（Ox）、CaOx晶體誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥損傷過(guò)程及對(duì)細(xì)胞間

2、緊密連接（TJ）結(jié)構(gòu)和功能的影響，并以排石沖劑進(jìn)行干預(yù)，探討排石沖劑防治尿路結(jié)石并能防止其復(fù)發(fā)的分子機(jī)制和作用靶點(diǎn)，為該方能更廣泛應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　采用以乙二醇和氯化銨為成石劑，建立CaOx結(jié)石大鼠模型。將雄性8-9周齡SPF級(jí)Wistar大鼠48只，適用性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為四組：空白對(duì)照組12只，給予生理鹽水灌胃，2ml/d；模型對(duì)照組12只，給予成石劑；排石沖劑治療組12只

3、，給予成石劑及排石沖劑配成1.2 g/ml的混懸液灌胃，2ml/d；枸櫞酸鉀治療組12只，給予成石劑及25%枸櫞酸鉀溶液灌胃，2ml/d。實(shí)驗(yàn)周期為28d。
　　收集大鼠24h尿液，由腹主動(dòng)脈血管采集血標(biāo)本，采用生化分析儀測(cè)定血清中BUN、Cr、Ca2+、Mg2+、P3+含量；取左腎置于4%多聚甲醛溶液中固定，后經(jīng)石蠟包埋，作常規(guī)切片，行HE染色和Von Kossa’s染色，并采用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB

4、、KIM-1、MCP-1、IL-6、OPN、AngII、AT1R、AT2R、ACE、ACE2及occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)情況。右腎置于液氮中，經(jīng)組織勻漿，分別做以下檢測(cè)：①對(duì)腎組織中SOD活性和MDA含量進(jìn)行檢測(cè)；②提取總RNA，采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠腎組織中TGF-β1、NF-κB、KIM-1、MCP-1、IL-6、OPN、AngII、AT1R、AT2R、ACE、ACE2和occludin、ZO-1的mRNA水平；③提取

5、總蛋白，采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)大鼠occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)量。
　　2體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　將大鼠腎小管上皮（NRK52E）細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，分為5組：空白對(duì)照組仍以5ml DMEM液進(jìn)行培養(yǎng)；Ox、一水草酸鈣（COM）損傷組換上含1.0mmol/L Ox+500μg/mL COM的5mlDMEM液進(jìn)行培養(yǎng)；治療對(duì)照組分別換上含1.0mmol/L Ox+500μg/mL COM及高、中、低濃度

6、含藥血清（含10%）的5ml DMEM液進(jìn)行培養(yǎng)。48h后移去上述培養(yǎng)液，取各組NRK52E細(xì)胞，以pH7.4的中性PBS液再?zèng)_洗2次，分別提取總蛋白質(zhì)及總RNA，采用Western Blotting技術(shù)及RT-PCR方法檢測(cè)occludin、ZO-1蛋白和mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1大鼠一般情況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均未死亡，模型對(duì)照組大鼠于實(shí)驗(yàn)第四周出現(xiàn)食欲減退，毛發(fā)不榮，飲水減少，尿量減少，精神倦怠，身體蜷

7、縮，且體重降低，尿量減少；而排石沖劑干預(yù)后，大鼠的體重和尿量均增加，精神狀況良好，飲食活動(dòng)基本正常。
　　2大鼠血尿生化情況：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠尿中Ox、Ca2+、P3+排泄量增加，Mg2+排泄量減少；血中BUN、Cr、Ca2+、P3+含量增加，Mg2+含量減少。而排石沖劑干預(yù)后，大鼠尿中Ox、Ca2+、P3+排泄量減少，Mg2+排泄量增加；血中BUN、Cr、Ca2+、P3+含量減少，Mg2+含量增加。結(jié)果表明：Ox

8、、CaOx晶體能導(dǎo)致大鼠尿中Ox、Ca2+、P3+等水平增加，結(jié)石形成抑制物 Mg2+水平降低，促進(jìn)結(jié)石的形成；排石沖劑的干預(yù)作用可能通過(guò)降低尿中Ox、Ca2+、P3+等的含量，升高M(jìn)g2+含量，從而抑制結(jié)石的形成。
　　3大鼠腎臟病理改變情況：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎組織色澤暗淡，明顯腫脹，有突出并散在分布的顆粒物，切面中心發(fā)白，且有大量的結(jié)晶形成，腎小管管腔擴(kuò)張明顯；而排石沖劑干預(yù)后，大鼠腎臟表面顏色正常，切面中心顏

9、色稍淡，且腎臟中結(jié)晶量較少，零星散在分布，少數(shù)腎小管有不同程度的擴(kuò)張。結(jié)果表明：Ox、CaOx晶體能使大鼠腎臟發(fā)生病理改變；排石沖劑可能通過(guò)干預(yù)病理改變過(guò)程，達(dá)到保護(hù)腎臟、防治結(jié)石的目的。
　　4大鼠腎組織中氧化應(yīng)激及炎癥損傷情況：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎組織中，SOD活力降低，MDA含量增加，TGF-β1、NF-κB、KIM-1、MCP-1、IL-6和OPNmRNA和蛋白的表達(dá)明顯增多；而排石沖劑干預(yù)后，大鼠腎組織中S

10、OD活力升高，MDA含量降低，TGF-β1、NF-κB、KIM-1等指標(biāo)的表達(dá)均降低。結(jié)果表明：Ox和CaOx晶體能降低SOD活力，升高M(jìn)DA含量，上調(diào)TGF-β1，增加ROS產(chǎn)生，上調(diào)NF-κB、MCP-1、IL-6等的表達(dá)，促進(jìn)腎上皮細(xì)胞的OS和炎癥損傷，增加OPN表達(dá)，促進(jìn)晶體粘附、核化和聚集；排石沖劑的干預(yù)作用可能通過(guò)升高SOD活力，降低MDA含量，直接或間接下調(diào)TGF-β1，減少ROS產(chǎn)生，下調(diào)NF-κB、MCP-1、IL-6

11、等的表達(dá)，以減輕腎上皮細(xì)胞的OS和炎癥損傷，調(diào)節(jié)腎組織中OPN蛋白表達(dá)水平，干預(yù)CaOx晶體的粘附、核化和聚集，從而達(dá)到抑制結(jié)晶的沉積，保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用。
　　5大鼠腎組織中RAS相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)情況：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎組織中，AngII、AT1R、ACEmRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，AT2R和ACE2mRNA和蛋白表達(dá)降低；而排石沖劑干預(yù)后，在大鼠腎組織中AngII、AT1R、ACE的表達(dá)有所增多，AT2R和

12、ACE2的表達(dá)有所降低。結(jié)果表明：Ox、CaOx晶體能激活了大鼠腎臟局部的RAS，通過(guò)ACE表達(dá)增加可將AngI轉(zhuǎn)化AngII，大量的AngII與AT1R結(jié)合發(fā)揮其促進(jìn)OS和炎癥損傷的作用，同時(shí)，AngII還能介導(dǎo)OPN的表達(dá)以促進(jìn)晶體成核和聚集；排石沖劑對(duì)CaOx結(jié)石干預(yù)作用可能是通過(guò)上調(diào) ACE2，將AngⅠ轉(zhuǎn)化為Ang-(1-9)，也可將AngII降解成Ang-(1-7)，從而使腎臟中AngII水平下調(diào)，并能通過(guò)上調(diào)AT2R的表達(dá)

13、，拮抗AT1R介導(dǎo)的AngII效應(yīng)，以減輕腎上皮細(xì)胞的OS和炎癥損傷，從而達(dá)到保護(hù)腎臟的目的。
　　6體內(nèi)外大鼠腎小管上皮細(xì)胞中TJ相關(guān)指標(biāo)表達(dá)情況：①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎組織中occludin、ZO-1的表達(dá)明顯減少；而排石沖劑干預(yù)后，在大鼠腎組織中的表達(dá)增多。②體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組中的occludin、ZO-1的表達(dá)明顯減少；而排石沖劑干預(yù)后，occludin、ZO-1的表達(dá)增多，

14、且隨著藥物血清濃度的增加，表達(dá)增多。結(jié)果表明：Ox和CaOx晶體可以直接或間接地（通過(guò)OS和炎癥損傷）作用于對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，破壞細(xì)胞間的TJ的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致腎小管內(nèi)結(jié)晶、鈣及草酸、磷酸等離子向腎上皮細(xì)胞間遷移，啟動(dòng)腎小管間質(zhì)的炎癥損傷和Randall′s斑塊的形成，這可能是結(jié)石形成和生長(zhǎng)的一個(gè)基礎(chǔ)；排石沖劑對(duì)Ox和CaOx晶體誘導(dǎo)的大鼠腎小管上皮細(xì)胞TJ蛋白改變具有恢復(fù)作用，這種作用可能通過(guò)抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮作用，也可能直

15、接作用于腎小管上皮細(xì)胞，以促進(jìn)細(xì)胞損傷恢復(fù)及減少結(jié)晶的黏附，干預(yù)結(jié)石的形成。
　　結(jié)論：
　　1采用乙二醇和氯化銨法復(fù)制CaOx結(jié)石大鼠模型成功。
　　2 Ox、CaOx晶體能通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的OS和炎癥損傷，促進(jìn)晶體粘附、核化和聚集；排石沖劑可能通過(guò)干預(yù)這個(gè)過(guò)程達(dá)到防治結(jié)石、保護(hù)腎臟的目的。
　　3 Ox、CaOx晶體能激活大鼠腎臟局部的RAS，以促進(jìn)OS、炎癥損傷及晶體成核和聚集