左卡尼汀在腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的保護(hù)作用研究.pdf

1、腎臟缺血再灌注損傷可發(fā)生于多種疾病情況下,如休克、外科手術(shù)、移植、糖尿病腎病、慢性腎小管-間質(zhì)損傷等,并伴隨著氧化應(yīng)激的增加。氧化應(yīng)激由活性氧介導(dǎo),包括自由基如超氧陰離子、羥基和非自由基如過氧化氫?；钚匝踉谀I組織中的腎小球、間質(zhì)腎小管、系膜細(xì)胞中產(chǎn)生,而組織中的抗氧化防御系統(tǒng)如低分子量抗氧化劑(抗壞血酸素C、谷胱甘肽、維生素E等)、ROS反應(yīng)酶(超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶)以及氧化還原調(diào)節(jié)酶等會(huì)同時(shí)被激活,抑制活性氧生成并降

2、解活性氧。若活性氧的產(chǎn)生量超過機(jī)體自身的清除能力,會(huì)同時(shí)破壞機(jī)體抗氧化酶,通過脂質(zhì)氧化、分解DNA、和蛋白變性等損傷細(xì)胞。腎移植過程中移植腎不可避免遭受缺血再灌注損傷,其中主要為氧化應(yīng)激損傷。腎臟冷保存時(shí)組織缺氧,移植恢復(fù)血液灌注后即激活瀑布式的炎癥反應(yīng),產(chǎn)生大量活性氧。移植后活性氧的增加可能還參與了慢性移植腎腎病的發(fā)生?；钚匝鯇?dǎo)致的線粒體腫脹,凋亡蛋白酶-3的激活,直接引起細(xì)胞壞死或凋亡。在腎臟缺血再灌注損傷后的第一個(gè)24小時(shí)內(nèi),抗凋

3、亡蛋白Bcl-2家族如Bcl-2和Bcl-XL,以及凋亡前蛋白Bax、p53、FADD和Bak在近曲、遠(yuǎn)曲小管的表達(dá)均增加,并且與損傷嚴(yán)重程度相關(guān)?？寡趸瘎┲委熌軠p輕氧化應(yīng)激,抑制細(xì)胞凋亡和壞死,改善移植物保存效果,減輕相關(guān)的損傷和炎癥反應(yīng)。
　　 左卡尼汀(L-carnitine,LC),一種L-賴氨酸的衍生物,是內(nèi)源性的線粒體膜復(fù)合物。人體左卡尼汀的主要生理作用是輔助長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)部進(jìn)入β氧化循環(huán),做為一種營(yíng)養(yǎng)添加

4、劑已應(yīng)用30余年。左卡尼汀對(duì)腎組織的保護(hù)作用已經(jīng)在多種氧化應(yīng)激模型中得到證實(shí),如:順鉑導(dǎo)致的腎或小腸損傷模型,慶大霉素引起腎毒性模型,腎的缺血再灌注模型以及慢性腎衰模型。左卡尼汀能抑制腎臟缺血再灌注損傷中血清和腎組織MDA的生成。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)左卡尼汀有清除DPPH、超氧陰離子、過氧化氫的能力,提高抗氧化酶的活性,如SOD,CAT和GPx等,并能降低腎組織中的MDA濃度。
　　 根據(jù)以上的發(fā)現(xiàn),本研究應(yīng)用人體近曲小管上皮細(xì)胞HK-2

5、作為細(xì)胞模型,研究左卡尼汀抗氧化作用的分子機(jī)制。作為活性氧的主要成員,過氧化氫在氧化還原過程中產(chǎn)生,被認(rèn)為是引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的信使。過氧化氫能引起脂質(zhì)過氧化和DNA損傷。因此,我們應(yīng)用過氧化氫誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激,驗(yàn)證使用左卡尼汀預(yù)處理能減輕過氧化氫對(duì)HK-2的氧化作用。在此基礎(chǔ)上,我們還進(jìn)一步研究了左卡尼汀在氧化應(yīng)激中ROS的生成,脂質(zhì)過氧化、抗氧化系統(tǒng)、線粒體功能和細(xì)胞凋亡情況。
　　 第一章 左卡尼汀對(duì)氧化應(yīng)激損傷腎

6、小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 目的：建立過氧化氫誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)氧化應(yīng)激損傷模型,探討左卡尼汀(L-carnitine,LC)對(duì)過氧化氫氧化應(yīng)激損傷人腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
　　 方法：用不同濃度的H2O2作用于人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2),四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力,建立造成腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型；實(shí)驗(yàn)分為5組:正常細(xì)胞組、H2O2損傷組、單獨(dú)LC組、LC保護(hù)組、

7、N-乙酰半胱氨酸(NAC)組,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力,采用酶化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性、以及測(cè)定其總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)水平；以氧化敏感的2,7-二氫二氯熒光素(DCFH-DA)染色,熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)強(qiáng)度,碘化丙啶(PI)染色流式細(xì)胞儀測(cè)定HK-2細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)組測(cè)量值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示

8、,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,各組比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：H2O2500μM×30min處理后HK-2細(xì)胞活性較正常細(xì)胞顯著降低(P<0.001),單獨(dú)應(yīng)用LC 10μM、50μM、100μM處理12小時(shí)HK-2細(xì)胞活力顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001),H2O2損傷前使用LC預(yù)處理12小時(shí)能抑制H

9、2O2損傷所導(dǎo)致的HK-2細(xì)胞活力降低(P<0.001)；H2O2500μM×30min處理后,細(xì)胞中SOD,GSH-Px和CAT含量及T-AOC顯著低于正常細(xì)胞組(P<0.001),而LC保護(hù)組,細(xì)胞中SOD,GSH-Px和CAT含量及T-AOC顯著高于H2O2損傷組(P<0.001)；H2O2損傷組MDA、ROS水平高于正常細(xì)胞組,細(xì)胞凋亡率高于正常細(xì)胞組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),而LC保護(hù)組MDA、ROS水平以及細(xì)胞凋

10、亡率均顯著低于H2O2損傷組(P<0.001)。表明腎小管上皮細(xì)胞在經(jīng)左卡尼汀預(yù)處理之后,抗損傷能力加強(qiáng),損傷程度減少。
　　 結(jié)論：左卡尼汀對(duì)氧化應(yīng)激所致的腎小管上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力,減少自由基生成,抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　 第二章 線粒體通路在左卡尼汀抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡中的作用
　　 目的：探討線粒體通路在左卡尼汀(L-carnitin

11、e,LC)對(duì)過氧化氫氧化應(yīng)激致人腎小管上皮細(xì)胞凋亡中的作用。
　　 方法：建立H2O2誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型；實(shí)驗(yàn)分為五組:正常細(xì)胞組、H2O2損傷組、單獨(dú)LC組、LC保護(hù)組、N-乙酰半胱氨酸(NAC)組；Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞凋亡,計(jì)算細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位和半胱天冬酶3(caspase-3)的活性；蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)活性蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)以及細(xì)胞色素C的釋放。各實(shí)

12、驗(yàn)組測(cè)量值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,各組比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)、組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：Hoechst 33258染色結(jié)果顯示H2O2損傷組出現(xiàn)典型的細(xì)胞致密濃染,核固縮、邊緣化等凋亡形態(tài)學(xué)改變；H2O2損傷組細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001),不同濃度LC保護(hù)組細(xì)胞凋亡率顯著低

13、于H2O2損傷組(P<0.001),且該效應(yīng)呈劑量依賴性；使用流式細(xì)胞議檢測(cè)H2O2損傷組caspase-3活性顯著高于正常對(duì)照組(P<0.001),而LC保護(hù)組caspase-3活性顯著低于H2O2損傷組(P<0.001)；過氧化氫作用可使HK-2細(xì)胞線粒體功能紊亂,H2O2損傷組較正常細(xì)胞組線粒體膜電位顯著降低(P<0.001),Bax/Bcl-2顯著升高(P<0.001),胞漿細(xì)胞色素C顯著升高(P<0.001)；而LC保護(hù)組較H