遺傳性抗凝蛋白缺乏所致靜脈血栓患者的分子診斷兩例血友病乙患者的基因診斷.pdf

1、第一部分遺傳性抗凝蛋白缺乏所致靜脈血栓患者的分子診斷
　　目的:研究近兩年于我院就診，且被診斷為蛋白C(PC)、蛋白S(PS)缺乏的反復深靜脈血栓或肺栓塞患者，對這些患者及其家系成員進行相應抗凝蛋白基因診斷和家系分析，探討導致PC、PS缺乏的分子發(fā)病機制。
　　方法:常規(guī)檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)以篩查凝血功能，發(fā)色底物法檢測PC活性(PC∶C)、PS活性(PS∶C)，以外

2、周血提取基因組DNA作為PCR反映模板，PCR法分別擴增患者PC、PS基因的所有外顯子及其側(cè)翼序列，通過直接測序并與相應基因的正常序列比對尋找基因突變點。
　　結(jié)果:共收集9名抗凝蛋白活性降低的先證者外周血標本及其病史資料。其中先證者4 PC缺乏，先證者1、2、3 PC合并PS缺乏。PC基因測序結(jié)果顯示在啟動子區(qū)域存在G4880A、C4867T、A5045T多態(tài)性位點。先證者1 PC與PS活性分別為48％、26.3％，測序發(fā)現(xiàn)PC

3、基因E2區(qū)域A6578T雜合突變，導致Thr18Ser，PS基因E4區(qū)域G68395T雜合突變，導致Arg90Leu;先證者2 PC聯(lián)合PS缺乏，PC與PS活性分別為27％、22.9％，PS基因E4區(qū)域G68428A雜合突變，導致Arg76His，E4 C68430T雜合突變，導致Gln101 Stop;先證者3 PC聯(lián)合PS缺乏，PC與PS活性分別為58％、57.3％， PC基因E7區(qū)域AGA12702-12704或AGA12705-

4、12707del，導致Arg192或Arg193del缺失突變，E9區(qū)域A15240G雜合突變，導致His370Arg，PS基因E4G68395T雜合突變，導致Arg90Leu，E9 G82512C雜合突變，導致Ser321Thr;先證者4為PC缺乏，PC活性50％，除多態(tài)性外，其余外顯子區(qū)域未找到突變位點;先證者5 PS缺乏，活性38.8％，PS基因E4 G68395T雜合突變，導致Arg90Leu，E14區(qū)域C102102T純合突變

5、，導致Gla616Val;先證者6為PS缺乏，活性為35.2％，E4區(qū)域G68395T雜合突變，導致Arg90Leu，E4 C68430T雜合突變，導致Gln101 Stop;先證者7為PS缺乏，活性為43.7％，E14區(qū)域存在C102102T純合突變，導致Gla616Val;先證者8為PS缺乏，活性為43.6％，E4 G68395T雜合突變，導致Arg90Leu，E4區(qū)C68430T雜合突變，導致Gln101 Stop;先證者9為PS

6、缺乏，活性7.7％，家系成員中三名自愿檢測基因，其中兩名PS缺乏(Ⅱ2，Ⅲ2)，E4 G68395T雜合突變(Ⅱ1，Ⅱ2，Ⅲ1，Ⅲ2)，導致Arg90Leu錯義突變。
　　結(jié)論:經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)的PC基因啟動子區(qū)多態(tài)性G4880A、C4867T、A5045T、錯義突變A6578T、A15240G、缺失AGA12702-12704或12705-12707del及PS基因錯義突變G68395T、G68428A、C86066T、G82512C

7、、C102102T、無義突變C68430T可能分別是導致患者相應抗凝蛋白活性降低的原因，其中，突變A6578T、A15240G、AGA12702-12704或12705-12707del、G68395T、G68428A、G82512C、C102102T、C68430T是國際首先發(fā)現(xiàn);突變C86066T香港曾有報道。
　　第二部分兩例血友病乙患者的基因診斷
　　目的:對南京市鼓樓醫(yī)院血友病登記中心登記的2例血友病乙患者進行凝血

8、因子Ⅸ(FⅨ)基因序列檢測，以發(fā)現(xiàn)基因突變的類型，探討導致血友病乙的分子發(fā)病機制。
　　方法:一期法檢測患者的凝血功能和血漿內(nèi)源性凝血因子活性，正?；旌涎獫{APTT糾正試驗排除抑制物。以純化樹脂法從患者外周血單核細胞中抽提DNA，PCR法擴增FⅨ基因(F9)的全部8個外顯子及其側(cè)翼序列，PCR產(chǎn)物純化后進行直接測序，比對正常人F9序列，尋找基因突變位點。
　　結(jié)果:2名血友病乙先證者的APTT均延長，但均可被正?；旌涎獫{AP