外周Th17-Treg失衡在肺腺癌及肺鱗狀上皮細胞癌中的作用及相關機制探討.pdf

1、肺癌無論是發(fā)病率還是死亡率,均居全球癌癥首位。按組織病理學分類,分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌,據(jù)估計,非小細胞肺癌(NSCLC)約占所有肺癌類型的80％,其中肺腺癌和肺鱗狀上皮細胞癌占據(jù)了NSCLC的絕大多數(shù)。近二十年來,雖然以含鉑類化療為主的綜合治療使肺癌的生存率有所延長,但是五年生存率仍然低于15%,并且由于化療的附加損害,肺癌患者的生活質量和實際生存期并未顯著改善,因此,探索新的治療手段,尋找更為有效的治療模式成為研究熱點。肺癌的

2、抗腫瘤免疫失衡研究可能為治療提供一種極具前景的治療模式。
　　CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)是兩類不同于Th1和Th2的CD4+T淋巴細胞。Treg細胞是CD4+T細胞的一類特殊分支,在維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受上發(fā)揮重要作用,可以避免免疫炎癥反應的擴大和減輕免疫機體損傷,在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮負向調節(jié)作用。在動物和人研究中發(fā)現(xiàn),調節(jié)性T細胞的缺失可以導致嚴重的自身免疫性炎癥;相反,

3、Treg細胞的增多也不利于機體,在許多癌癥中,增加的Treg細胞通過與自身免疫監(jiān)控系統(tǒng)的相互作用,抑制抗腫瘤免疫活性細胞,促進了癌癥的進展。Foxp3是Treg細胞特異的標記物,Foxp3屬轉錄因子Forkhead家族,它可以控制Treg細胞的發(fā)生發(fā)育,剔除FoxpTreg細胞和Th17細胞之間存在復雜的相互關系,二者在分化上相互聯(lián)系,在功能上相互拮抗,二者的平衡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。目前,Th17/Treg的平衡紊亂已經(jīng)成為

4、惡性腫瘤研究領域中新的熱點,但是,在非小細胞肺癌中的研究尚少,是否存在比較顯著的Th17/Treg紊亂尚不清楚,與不同分期NSCLC的關系有待進一步探討。
　　目的：
　　通過分析Th17/Treg失衡與不同分期NSCLC的關系,分析相關轉錄因子及細胞因子的水平變化,探討 Th17/Treg失衡在 NSCLC發(fā)病中的分子機制,明確Th17/Treg失衡在NSCLC中的意義。
　　方法：
　　1.收集59例非小細胞

5、肺癌患者及健康對照外周血標本
　　臨床病理確診患者30例鱗癌、29例腺癌和10名健康對照的外周血標本,標本分為兩份,一份用于細胞分型、mRNA、蛋白質檢測;另一份凍存以備細胞因子檢測。
　　2.多參數(shù)流式細胞術檢測肺腺癌和肺鱗癌外周血單個核細胞中Treg細胞和Th17細胞表達率
　　分別檢測59例NSCLC患者外周血單個核細胞中Treg細胞和Th17細胞在T細胞中的表達率。
　　3. Real time quan

6、titative PCR檢測非小細胞肺癌外周血單個核細胞中RORγt及FoxP3mRNA水平
　　分別提取非小細胞肺癌外周血有核細胞總RNA,用RT-PCR法檢測Th17細胞轉錄因子RORγt和Treg細胞FoxP3 mRNA表達水平。
　　4. Western-blotting檢測非小細胞肺癌外周血單個核細胞中RORγt和Foxp3蛋白表達水平
　　分別提取分別提取非小細胞肺癌外周血單個核細胞總蛋白,采用wester

7、n-blotting方法分別檢測RORγt和Foxp3蛋白表達情況。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附法檢測非小細胞肺癌外周血清中細胞因子的水平
　　用ELISA試劑盒分別檢測非小細胞肺癌外周血清細胞因子IL-6、IL-17、IL-10和TGF-β1的水平。
　　結果：
　　1.59例非小細胞肺癌患者的臨床資料
　　59例非小細胞肺癌患者,其中鱗癌30例,男性18例,女性12例,年齡56-81歲,平均年齡64.7歲;腺

8、癌29例,男性18例,女性11例,年齡55-80歲,平均年齡63.0歲,所有患者均符合WHO診斷與分期標準,Ⅰ期7人,Ⅱ期13人,Ⅲ期19人,Ⅳ20人。同期選擇10名健康志愿者作為對照。
　　2.非小細胞肺癌外周血中Treg細胞表達率升高
　　流式細胞學分析結果表明:與對照組相比,鱗癌組外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg細胞表達率顯著升高(5.598±0.227%vs.3.444±0.2974%, P<0.0

9、5);腺癌組也顯著升高(7.237±0.377%vs.3.444±0.2974%,P<0.05)。
　　3.非小細胞肺癌外周血中Th17細胞表達率下降
　　流式細胞學分析結果表明:與對照組相比,鱗癌患者外周血中Th17細胞表達率(0.4313±0.0209% vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)明顯下降,腺癌組(0.3624±0.0273%vs.0.6090±0.0558%, P<0.05)也顯著下降。

10、>　　4.非小細胞肺癌外周血中Th17/Treg比率下降,且與分期呈負相關
　　比較分析 Th17/ Treg比率表明:與健康對照組相比,腺癌(0.1865±0.0212 vs.0.1865±0.0212,P<0.05)及鱗癌(0.0547±0.0054 vs.0.1865±0.0212, P<0.05) Th17/Treg比率明顯下降,且分期越差,比例下降越明顯,Th17/Treg比例與NSCLC分期呈負相關。
　　5.非

11、小細胞肺癌外周FoxP3mRNA表達顯著升高,但RORγtmRNA表達降低
　　RT-PCR結果表明:與健康對照組相比,鱗癌 Treg細胞相關轉錄因子FoxP3mRNA表達顯著升高(0.9957±0.1799 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),腺癌FoxP3mRNA表達顯著升高(1.681±0.2401 vs.0.07382±0.01382,P<0.05),鱗癌Th17細胞相關轉錄因子RORγt表達降低(2.1

12、01±0.2759 vs.4.202±0.9663,P<0.05),腺癌RORγt表達降低(1.126±0.1725 vs.4.202±0.9663,P<0.05),鱗癌組與腺癌組相比 FoxP3mRNA(0.9957±0.1799 vs.1.681±0.2401, P>0.05), RORγtmRNA(2.101±0.2759 vs.1.126±0.1725 P>0.05)無明顯差異。
　　6.非小細胞肺癌Foxp3蛋白表達顯著

13、升高,但RORγt蛋白表達下降
　　Western-blotting結果表明:肺鱗癌和腺癌患者的 Foxp3蛋白表達分別是健康對照組的3.245( P<0.05),5.119( P<0.05),腺癌組Foxp3表達水平高于鱗癌組(5.119 vs.3.245,P<0.05);鱗癌及腺癌組RORγt蛋白表達水平分別是健康對照組的0.6693( P<0.05),0.5456( P<0.05),兩者RORγt蛋白表達水平無差異(0.66

14、93 vs.0.5456,P>0.05)。
　　7.非小細胞肺癌外周血清中IL-10、TGF-β1顯著升高,IL-6、IL-17顯著降低
　　ELISA法結果表明:與健康對照比較,鱗癌外周血清Treg細胞相關因子IL-10(898±52.45 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL,P<0.05)、TGF-β1(408.9±25.5 ng/mL vs.189.4±27.51 ng/mL,P<0.05)顯著升高

15、;鱗癌組 Th17細胞相關因子 IL-6(327.8±44.44 ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL,P<0.05)、IL-17(588.3±71.67 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)顯著下降;與健康對照比較,腺癌IL-10(1458±145.8 ng/mL vs.362.00±53.25 ng/mL, P<0.05)、TGF-β1(541.5±32.9 ng/mL vs.189.4±2

16、7.51 ng/mL,P<0.05)升高,IL-6(369.5±61.5ng/mL vs.2139±787.7 ng/mL, P<0.05)、IL-17(613.6±92.06 ng/m vs.1557±375.8 ng/mL,P<0.05)顯著下降。
　　結論：
　　1.非小細胞肺癌常見病理類型腺癌和鱗癌外周Th17/Treg平衡紊亂,Treg細胞表達顯著增強,Th17細胞表達率下降,相關轉錄因子RORγt和Foxp3,相