PPARγ激動劑對RSV感染的肺泡上皮細胞趨化因子MCP-1,MIP-1α表達的影響.pdf

1、目的：
　　1.研究A549細胞RSV感染12h、24h、48h后A549細胞趨化因子MCP-1、MIP-1αmRNA表達和蛋白水平。
　　2.觀察不同劑量過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)激動劑15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和羅格列酮及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活性特異性抑制劑(PDTC)及PPARγ拮抗劑(GW9662)干預后各時間點MCP-1、MIP-1αmRNA表達和蛋白水平的變化，探討并比較天然和合成

2、PPARγ激動劑對RSV感染趨化因子表達的影響及機制。
　　3.為臨床應用PPARγ激動劑治療RSV感染提供理論和實驗依據(jù)，為RSV感染的治療提供新的途徑。
　　方法：
　　1.將A549細胞進行體外傳代培養(yǎng)，并進行RSV增殖及接種，建立體外RSV感染的細胞模型。將傳代培養(yǎng)的細胞隨機分成7組：A組(15d-PGJ2+RSV組)，B組(羅格列酮+RSV組)、C組(RSV組)、D組(DMSO+RSV組)、E組(PDTC+R

3、SV組)、F組(GW9662+羅格列酮+RSV組)、G組(細胞對照組)。各組分別在培養(yǎng)12h、24h、48h收獲細胞及上清液待測。A組先以10-20μmol/L的15d-PGJ2預處理0.5h，再加100TCID50RSV吸附2h后加培養(yǎng)液37℃、5％CO2培養(yǎng)；B組先以10-30μmol/L的羅格列酮預處理0.5h，再加100TCID50RSV吸附2h后加培養(yǎng)液培養(yǎng)；D組先以10μmol/L的PDTC預處理0.5h，再加100TCID

4、50RSV吸附2h后加培養(yǎng)液培養(yǎng)；E組先以10μmol/L的GW9662預處理0.5h，再加10μmol/L的羅格列酮作用2h后以100TCID50RSV吸附2h，然后加培養(yǎng)液培養(yǎng)；C組先以0.01%(v/v)DMSO預處理0.5h，再加100TCID50RSV吸附2h后加培養(yǎng)液培養(yǎng)；F組先以0.01%DMSO預處理0.5h，再以不含RSV的培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組分別在培養(yǎng)12h、24h、48h收獲細胞及上清液待測。
　　2.應用ELI

5、SA檢測各組上清液MCP-1、MIP-1α蛋白水平，實時定量RT-PCR檢測各組趨化因子MCP-1、MIP-1αmRNA表達。
　　3.比較不同劑量的15d-PGJ2和羅格列酮對RSV感染趨化因子表達的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1.病毒滴度的測定：病毒的半數(shù)感染量(TCID50)通過Reed-Muench公式計算為10-4.5/50μl。本實驗中造模采用的病毒攻擊量為100TCID50，即10-2.550μl。

6、>　　2.RSV感染后MCP-1、MIP-1α蛋白和mRNA表達的變化
　　1)MCP-1蛋白和mRNA：與G組相比，C組MCP-1蛋白及mRNA表達在12h均開始升高，蛋白的表達量在48h達高峰，與12h比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而mRNA的表達量在24h達高峰，48h有所下降，與12h的表達量相近，差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；C組在各個時間點MCP-1蛋白和mRNA表達量均高于E組(P<0.05)。E組各個

7、時間點的MCP-1蛋白和mRNA表達量仍明顯高于G組(均P<0.05)。
　　2)MIP-1α蛋白和mRNA：與G組相比，C組MIP-1α蛋白及mRNA表達在12h均開始明顯升高，蛋白的表達量在48h達高峰，與12h比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；而mRNA的表達量在24h達高峰，48h有所下降，與12h的表達量相近，差異無統(tǒng)計意義(均P>0.05)；C組在各個時間段的MIP-1α蛋白和mRNA表達量均高于E組(P<0.0

8、5)。E組各個時間點的MIP-1α蛋白和mRNA表達量仍明顯高于G組(均P<0.05)。
　　3.PPARγ激動劑干預對RSV感染的MCP-1、MIP-1α蛋白和mRNA和表達的影響1)MCP-1蛋白和mRNA：A組、B組與C組相比，MCP-1蛋白及mRNA的表達量均明顯降低(均P<0.01)，與F組相比，MCP-1蛋白及mRNA的表達量均降低(均P<0.05)。F組與C組的MCP-1蛋白及mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0

9、.05)。
　　2)MIP-1α蛋白和mRNA：A組、B組與C組相比，MIP-1α蛋白及mRNA的表達量均明顯降低(均P<0.01)，與F組相比，MIP-1α蛋白及mRNA的表達量均降低(均P<0.05)。F組與C組的MIP-1α蛋白及mRNA的表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　4.不同濃度的PPARγ激動劑對RSV感染的趨化因子MCP-1、MIP-1αmRNA和蛋白表達的影響
　　1)MCP-1蛋白和mR

10、NA：A組、B組與C組相比，24hMCP-1mRNA的表達量隨著劑量的增加而下降(均P<0.01)；48hMCP-1蛋白的表達量隨著劑量的增加表達下降(均P<0.05)。24hA組10μmol/L15d-PGJ2干預后MCP-1mRNA的表達量與B組相同劑量的羅格列酮相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而20μmol/L15d-PGJ2和同劑量的羅格列酮相比，在各時間點的MCP-1mRNA的表達量均明顯減少(P<0.05)；20μm

11、ol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預后MCP-1mRNA的表達量最低，與G組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。在48h，A組10μmol/L15d-PGJ2和B組相同劑量的羅格列酮干預后MCP-1蛋白表達量相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而20μmol/L15d-PGJ2與相同劑量的羅格列酮相比，在各時間點的MCP-1蛋白表達均明顯減少(均P<0.05)。A組15μmol/L和20μmol/L的15d-

12、PGJ2，B組20μmol/L和30μmol/L的羅格列酮與C組相比，MCP-1蛋白的表達量均顯著降低(均P<0.01)；其中20μmol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預后MCP-1蛋白的表達量最低，與G組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　2)MIP-1α蛋白和mRNA：A組、B組與C組相比，24hMIP-αmRNA的表達量隨著劑量的增加而下降(均P<0.01)，48hMIP-α蛋白的表達量隨著劑量

13、的增加而下降(均P<0.05)。24hA組10μmol/L15d-PGJ2干預后MIP-αmRNA的表達量與B組相同劑量的羅格列酮相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而20μmol/L15d-PGJ2和相同劑量的羅格列酮相比，在各時間點的MIP-αmRNA表達量均明顯減少(P<0.05)；20μmol/L15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預后MIP-αmRNA的表達量最低，與G組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。4

14、8hA組10μmol/L15d-PGJ2和B組相同劑量的羅格列酮干預后MIP-μ蛋白表達量相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而20μmol/L15d-PGJ2和相同劑量的羅格列酮相比，在各時間點MIP-α蛋白的表達均明顯減少(均P<0.05)。A組15μmol/L和20μmol/L的15d-PGJ2，B組20μmol/L和30μmol/L的羅格列酮與C組相比，MIP-α蛋白的表達量均顯著降低(均P<0.01)，其中20μmol/L

15、15d-PGJ2和30μmol/L羅格列酮干預后的MIP-α蛋白表達量最低，與G組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.RSV感染可導致MCP-1、MIP-1αmRNA及蛋白表達升高；2種趨化因子蛋白的表達自感染后12h明顯增加，高峰時間在48h；而基因的表達在則自感染后12h開始明顯增加，高峰時間在24h。
　　2.15d-PGJ2、羅格列酮及PDTC均可降低RSV感染后MCP-1、MIP-