CNP-NPR-B-cGMP信號通路在腎缺血再灌注損傷中的作用.pdf

1、腎缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是腎組織缺血時和其后恢復血液灌注時器官功能不能恢復正常，甚至發(fā)生更為嚴重的組織損傷或器官功能衰竭。腎臟由于其組織結構和功能的特殊性，對缺血再灌注損傷特別敏感，臨床上常見因缺血引起急性腎功能衰竭（acute renal failue，ARF）的發(fā)生，如急性缺血性腎功衰竭、心肺復蘇、心臟體外循環(huán)、失血性休克、嚴重脫水、彌散性血管內(nèi)凝血、心臟手術及腎臟移植術等過

2、程中，特別是多器官功能衰竭的危重患者幾乎都伴有ARF的發(fā)生。盡管進行積極的對癥支持治療，但還是出現(xiàn)很高的發(fā)病率和死亡率。實驗證明，心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）可有效地減輕心臟、肝臟及胃等器官的缺血再灌注損傷，起明顯的保護作用。近年來研究表明，ANP對大鼠腎缺血再灌注損傷也具有保護作用，其保護作用是增加腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）和腎髓質(zhì)的血流量

3、，減輕髓質(zhì)部生成表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）細胞的損傷，恢復腎小管上皮細胞的完整性；ANP可減輕中性白細胞的活性，抑制其釋放各種炎癥介質(zhì)和氧自由基的生成保護腎功能，但其作用機制尚不清楚。
　　鈉尿肽（natriuretic peptides，NPs）是新發(fā)現(xiàn)的肽類激素，主要有ANP、腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）及C-型鈉尿肽（C-type nat

4、riuretic peptide，CNP）等，其共有的效應是利尿、排鈉、舒張血管、降低血壓和調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡。ANP和BNP主要由心臟合成和分泌，而 CNP主要由內(nèi)皮細胞分泌，是腦或神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達的神經(jīng)遞質(zhì)。現(xiàn)已確認能與鈉尿肽結合的受體有三種亞型：A型鈉尿肽受體（natriuretic peptide receptor type A，NPR-A）、B型鈉尿肽受體（natriuretic peptide receptor type B

5、，NPR-B）及清除型鈉尿肽受體（natriuretic peptide clearance receptor，NPR-C）。ANP和BNP主要與NPR-A結合，CNP則主要與NPR-B結合而發(fā)揮其生物學效應。研究表明，鈉尿肽及其受體廣泛分布在腎臟，但是NPs-NPR-cGMP系統(tǒng)在腎缺血再灌注的病理生理學作用尚不甚清楚。為此，本研究從形態(tài)學和分子生物學等角度觀察和探討 CNP-NPR-B-cGMP信號通路在腎缺血再灌注損傷中的作用及其

6、機制。
　　本研究利用大鼠腎缺血再灌注模型，制備血清樣本測定肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urine nitrogen，BUN）等腎功能指標，且利用光鏡和電鏡觀察腎組織形態(tài)學及腎組織超微結構，利用放射免疫分析和酶聯(lián)免疫法測定血清CNP濃度，采用RT-PCR和免疫組織化學方法觀察CNP及NPR-B mRNA的表達和分布。另外，取24只SD大鼠隨機分為假手術組（sham）、腎缺血再灌注組（ischemia r

7、eperfusion，IR）及腎缺血再灌注即時CNP給藥組（IR+CNP）（每組8只），測定血清Cr、BUN及腎組織SOD活性及MDA含量，且利用光鏡觀察腎組織形態(tài)學變化和采用免疫印跡技術觀察腎組織Bax、Bcl-2的表達變化。
　　實驗結果如下：
　　1.大鼠腎缺血再灌注組血清 Cr、BUN水平且明顯高于假手術組（n=8，P<0.01），并呈現(xiàn)時間依賴性特征。
　　2.假手術組腎臟組織結構清楚，腎小管上皮細胞完整，只

8、有輕度炎性細胞浸潤；IR組肉眼觀察可見腎臟體積明顯增大而質(zhì)軟，剖面見腎髓質(zhì)呈暗紅色；皮質(zhì)腫脹而蒼白。顯微鏡下觀察，IR組近端腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，細胞扁平，管腔擴張，刷狀緣脫落消失，管腔內(nèi)有脫落的上皮、管型和炎癥滲出物；基底膜裸露，甚至呈現(xiàn)腎小管細胞的節(jié)段性灶狀壞死。腎小管間質(zhì)有不同程度的炎癥細胞浸潤和水腫。遠端腎小管和集合管管腔內(nèi)可見細胞碎片或顆粒管型，腎小管基底膜節(jié)段性斷裂，斷裂部位可見淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤，腎

9、間質(zhì)彌漫并水腫。sham組電鏡下超微結構基本正常，線粒體嵴完整，未見腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結構完整，排列整齊；IR組電鏡下可見腎小管上皮細胞微絨毛脫落，線粒體腫脹、線粒體嵴消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，初級和次級溶酶體增多，吞噬空胞亦可見有增多現(xiàn)象。甚至上皮細胞崩解脫落，僅可見裸露或斷裂的基底膜。
　　3.假手術組及缺血再灌注組不同時間段（0/1/2/4h）血清CNP含量無明顯差異（n=8，P>0.05）。
　　4.缺血再灌注組腎組織CNP

10、mRNA表達明顯上調(diào)，且在再灌注2 hour時表達最高（n=8，P<0.05）。
　　5.假手術組及缺血再灌注組腎組織NPR-B均呈陽性，可見到散在分布的棕色顆粒，但與假手術組相比再灌注組呈陽性的棕色顆粒明顯增多，染色明顯加深。另外，缺血再灌注組大鼠腎組織中NPR-B mRNA表達明顯高于正常對照組。
　　6.假手術組腎臟組織結構清楚，腎小管上皮細胞完整，只有輕度炎性細胞浸潤；再灌注組腎臟體積明顯增大而質(zhì)軟，剖面見腎髓質(zhì)呈暗

11、紅色；皮質(zhì)腫脹而蒼白。顯微鏡下近端腎小管上皮細胞空泡及顆粒變性，細胞扁平，管腔擴張，刷狀緣脫落消失，管腔內(nèi)有脫落的上皮、管型和炎癥滲出物，基底膜裸露，甚至可見腎小管細胞的節(jié)段性灶狀壞死。腎小管間質(zhì)可有不同程度的炎癥細胞浸潤和水腫，遠端腎小管和集合管管腔內(nèi)可見細胞碎片或顆粒管型。腎小管基底膜節(jié)段性斷裂，斷裂部位可見淋巴細胞、單核細胞及中性粒細胞浸潤，腎間質(zhì)彌漫水腫。腎小球和腎小動脈未見明顯改變。CNP組腎小管排列基本正常，以腫脹為主，腎間

12、質(zhì)水腫、充血，炎性細胞浸潤不明顯。
　　7.缺血再灌注組24小時后血清 Cr、BUN水平明顯高于假手術組（n=8，P<0.001）；CNP即時給藥組較缺血再灌注組明顯下降（n=8，P<0.05）。
　　8.缺血再灌注組與假手術組相比 MDA含量顯著升高，SOD活性顯著下降（n=8，P<0.01和P<0.05）；CNP即時給藥組與IR組相比MDA含量明顯減少，SOD活性有所提高（n=8，P<0.01和P<0.05）。
　

13、　9.與假手術組及CNP即時給藥組相比，缺血再灌注組腎組織Bax表達明顯增加（n=8，P<0.05），而Bcl-2的表達在3組之間無明顯差異，但是CNP即時給藥組Bax/Bcl-2比值降低（n=8，P<0.05）。
　　以上結果提示：
　　1.腎缺血再灌注時組織結構和功能明顯受到損傷，尤其在皮髓交界區(qū)和髓質(zhì)部位。
　　2.腎缺血再灌注損傷時腎組織CNP及NPR-B的表達明顯上調(diào)。
　　3. CNP明顯改善缺血再灌