CMY-39型AmpC酶的原核表達(dá)和特性研究.pdf

1、目的：對(duì)從臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌（標(biāo)本號(hào)90757）產(chǎn)生的CMY-39型AmpC酶蛋白進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)和酶特性研究。
　　方法：（1）對(duì)弗勞地枸櫞酸桿菌作頭孢西丁敏感試驗(yàn)及三維試驗(yàn)以檢測(cè)AmpC酶，提取菌株質(zhì)粒進(jìn)行CIT序列擴(kuò)增并確定其基因分型。
　?。?）參照Genbank上的CMY-39型AmpC酶基因序列設(shè)計(jì)合成CMY-39基因的PCR引物，以90757號(hào)菌的總基因組作為模板，PCR擴(kuò)增CMY-39的編碼基因，將C

2、MY-39的PCR產(chǎn)物純化后與pGEM-T載體連接，測(cè)定CMY-39的核苷酸序列。
　?。?）將CMY-39基因克隆到PET-32a(+)系統(tǒng)進(jìn)行重組，重組質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達(dá)，SDS-PAGE電泳鑒定酶蛋白的表達(dá)。
　?。?）取CMY-39重組菌和原菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，提取重組菌的CMY-39蛋白進(jìn)行三維試驗(yàn)和Western blot檢測(cè)，并對(duì)此酶蛋白進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果：（1）證實(shí)90

3、757號(hào)菌株為產(chǎn)CMY-39型AmpC酶的弗勞地枸櫞酸桿菌，序列分析結(jié)果顯示目的基因片段長(zhǎng)1146bp，經(jīng)GenBank同源性比較，目的基因的氨基酸序列與GenBank上登錄的CMY-39編碼基因同源性為99％，它是CMY-39的突變株，為新型的CMY基因型，GenBank登陸號(hào)為HM565135。
　　（2）成功構(gòu)建PET32a(+)/CMY-39重組質(zhì)粒，經(jīng) XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到大小為1146bp和5901bp左

4、右的片斷。
　?。?）SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，重組菌株經(jīng)18℃誘導(dǎo)過(guò)夜后可見(jiàn)明顯特異性表達(dá)條帶，分子量約60KD。
　?。?）藥物敏感試驗(yàn)顯示，CMY-39重組菌株保持了產(chǎn)CMY型酶菌株的耐藥特征，對(duì)第一、二代頭孢菌素和頭霉素類表現(xiàn)為耐藥，對(duì)第三、四代頭孢菌素，氨基糖苷類和碳青霉烯類表現(xiàn)為敏感，耐藥性不被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，如他唑巴坦抑制。
　　（5）酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，重組酶測(cè)定的Km值與原菌株相比，均有不同程度