影響神經干細胞體外分化后突觸形態(tài)與功能的相關因素研究.pdf

1、第一部分： 目的：研究胎鼠海馬神經干細胞（NPCs）體外培養(yǎng)方法、了解其分化及超微結構特點。 方法：分離胎鼠海馬NPCs，應用機械分離法將海馬組織制成單細胞懸液，用含有bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代后用含血清培養(yǎng)基促分化，免疫細胞化學方法對NPCs及其分化后的子代神經細胞進行鑒定，并在電鏡下觀察分化后細胞的形態(tài)結構特征。 結果：海馬NPCs在無血清培養(yǎng)基中懸浮成球，貼壁后，細胞逐漸從細胞球向周圍遷移分化

2、。體外培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs表達巢蛋白（nestin），在體外可誘導分化產生分別表達Tuj-1和GFAP的神經細胞。電鏡觀察到分化后的神經細胞及突起相互間排列、具有各種細胞器結構，可見細胞間緊密連接，完整的突觸結構。 結論：采用無血清培養(yǎng)基中加入特定生長因子的培養(yǎng)技術，可培養(yǎng)出在體外穩(wěn)定增殖并有多向分化潛能的大鼠胚胎NPCs。 第二部分： 目的：探討腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）對體外培養(yǎng)的胎鼠海馬神經干細胞（NP

3、Cs）分化后突觸形態(tài)與功能的影響。 方法：采用無血清培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs，加入含有40 ng/mL的BDNF促分化培養(yǎng)基，以含有2％ B27和1％胎牛血清的DMEM/F12促分化培養(yǎng)基做對照，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化，體外誘導分化14 d后，通過免疫細胞化學和Western blot檢測突觸囊泡蛋白（SYN）的表達，采用實時熒光成像技術在激光掃描共聚焦顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測細胞受50 mmoL/L的高濃度Kcl溶液

4、刺激前后的熒光強度變化。 結果：分化后的海馬NPCs經BDNF處理后證實：免疫熒光細胞化學染色及Western blot中SYN蛋白的表達高于對照組；實時熒光成像技術顯示突觸循環(huán)功能強度高于對照組。 結論：BDNF能促進海馬NPCs分化后突觸形態(tài)與功能的表達。 第三部分： 目的：探討星形膠質細胞（AST）對胎鼠海馬神經干細胞（NPCs）分化后神經元電生理特征的影響。 方法：采用無血清培養(yǎng)基體外分離

5、培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs，含血清培養(yǎng)基體外分離培養(yǎng)新生鼠海馬AST，免疫細胞化學方法對NPCs和AST進行鑒定；在共同培養(yǎng)下AST誘導NPCs分化為神經元，以促分化培養(yǎng)基和加入含有40 ng/mL的BDNF促分化培養(yǎng)基做對照，采用全細胞膜片鉗技術記錄分化的神經元的離子通道、動作電位及突觸后電流等電生理指標。 結果：體外培養(yǎng)胎鼠海馬NPCs表達巢蛋白（nestin），體外培養(yǎng)新生鼠海馬AST表達膠質纖維蛋白（GFAP）；共同培養(yǎng)條件下