桃拉綜合征病毒分子檢測、全基因組特性分析及CP2結(jié)合蛋白的噬菌體肽庫篩選.pdf

1、桃拉綜合征病毒的分子流行病學(xué) 桃拉綜合征病毒(Taura syndrome virus，TSV)是引起全球?qū)ξr尤其是凡納濱對蝦(Penaeus vannami)急性傳染病的病原之一，近年來經(jīng)常在我國引發(fā)蝦病。但到目前為止，中國很少做過TSV的流行病學(xué)調(diào)查。采集漳州、廈門、深圳、陽江、寧波、廣州、?？?個(gè)地區(qū)31個(gè)養(yǎng)殖場的對蝦共310尾，以RT-PCR技術(shù)檢測TSV。結(jié)果310尾對蝦中有166尾感染TSV，陽性率達(dá)到53.5％。各地凡納濱

2、對蝦感染TSV的陽性率分別為100％(漳州)、97％(廈門)、33.3％(深圳)、40.7％(陽江)、50％(寧波)、40％(廣州)，表明凡納濱對蝦在各地均有一定比例感染TSV。用Southern blot雜交和測序驗(yàn)證RT-PCR反應(yīng)的特異性?？寺y序的結(jié)果通過Biast與Genbank中的序列進(jìn)行比對，各地TSV分離株231bp核苷酸同源性為98.7～100％，將這些序列繪制成基因樹，與已發(fā)表的序列比較，顯示：美國分離株HI94、墨

3、西哥分離株MXl、臺灣分離株TWl及巴西分離株BLZ01分布在一個(gè)分支上；越南株(YNl)與本次測序的21個(gè)中國大陸株分布于另一分支上。這21個(gè)中國株聚集成群，與越南株形成并列的兩個(gè)分支。而來自廣州的5個(gè)分離株(GUZ2、GUZ16、GUZ25、GUZ29、GUZ31)又聚集成群與深圳的2個(gè)分離株(SZB4、SZB6)構(gòu)成中國株的一個(gè)子分支。 桃拉綜合征病毒中國株的全基因測序及分 析設(shè)計(jì)8對引物分片段擴(kuò)增桃拉綜合征病毒

4、中國分離株ZHZC3全基因組，病毒兩末端序列采用末端快速擴(kuò)增方法(RACE)獲取。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測序，用DNAstar軟件拼接全序列及同源性比較。結(jié)果顯示ZHZC3全序列除去3′poly(A)尾，由10202個(gè)堿基組成，有兩個(gè)開放閱讀框，分別編碼2107和1011個(gè)氨基酸的聚蛋白。與美國參考株H194相比，在編碼區(qū)沒有核苷酸的缺失和插入，但在5′UTR缺失3個(gè)A，兩者整體核酸同源性達(dá)97.9％。ORF1中ZHZC3與

5、HI94及巴西株(BLZ01)的核酸同源性分別為97.6％、97.7％，在ORF2中ZHZC3與HI94、BLZ01的核酸同源性則分別為98.3、97％。與國外株ORF2的部分序列比較發(fā)現(xiàn)：ZHZC3和中國臺灣株均與美國株HI94同源性最高?？寺》治?株TSV中國大陸株主要結(jié)構(gòu)蛋白CP2基因，發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸存在三個(gè)高變區(qū)，中國大陸株更有其獨(dú)特的氨基酸變異模式，312(S)，449(A)，451 Q)和468(H)。表明該病毒的整體變

6、異性不高，但中國的流行株已形成其自己的遺傳演變特征。在此基礎(chǔ)上，利 用生物學(xué)軟件對CP2蛋白功能域和三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，為進(jìn)一步分析CP2蛋白結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。ZHZC3株是第一個(gè)測定全序列的TSV中國株。 桃拉綜合征病毒CP2蛋白高變區(qū)的表達(dá)、純化及多價(jià)抗血清制備根據(jù)重組質(zhì)粒pMD-CP2的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成了一對引物，用于擴(kuò)增TSV CP2基因高變區(qū)376～1371bp。在對該CP2高變區(qū)基因及pE

7、T-32a載體雙酶切后進(jìn)行連接，構(gòu)建了高效原核表達(dá)載體pET—CP2，測序驗(yàn)證其序列正確。將pET—CP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌后，對培養(yǎng)條件及誘導(dǎo)表達(dá)條件等因素進(jìn)行優(yōu)化。0.8mmol/L IPTG濃度、28℃溫度及低速振蕩可實(shí)現(xiàn)TSV CP2蛋白基因的高效可溶性表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測可見約56kD大小的融合蛋白。隨后用His-Bind對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，經(jīng)二次純化的蛋白可滿足實(shí)驗(yàn)要求。在此基礎(chǔ)上，以純化的重組C

8、P2蛋白免疫家兔，獲得抗血清。通過ELISA方陣試驗(yàn)，確定CP2最佳包被濃度為1μg/mL，血清稀釋度為l：2<'17>。純化CP2蛋白及抗血清的獲得為下一步應(yīng)用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選其結(jié)合肽提供了實(shí)驗(yàn)材料。 用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選TSV CP2高變區(qū)蛋白的結(jié)合蛋白以TSV重組CP2高變區(qū)蛋白作為篩選分子，對噬菌體展示12肽庫進(jìn)行親和淘選。經(jīng)過4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”淘洗后，所得的噬菌體回收率逐步提高，由6.4×10<'-5>上升到

9、2.8×10<'-2>，顯示淘選過程對隨機(jī)肽庫有很好的富集效果。ELISA結(jié)果顯示第4輪淘篩的多克隆噬菌體肽庫對CP2蛋白有良好的結(jié)合力。隨機(jī)挑選第4輪淘篩后的36個(gè)單克隆噬菌體，ELISA鑒定有24個(gè)單克隆(66.6％)為強(qiáng)陽性。并且這些單克隆噬菌體短肽能競爭抑制CP2抗血清與CP2蛋白的結(jié)合反應(yīng)，抑制作用隨噬菌體濃度升高而加強(qiáng)。將這24個(gè)陽性克隆擴(kuò)增、測序，推導(dǎo)隨機(jī)多肽的氨基酸序列。分析發(fā)現(xiàn)，有7個(gè)克隆(克隆號2、6、7、9、18、