耐藥肺癌干細胞的分離、鑒定及多梳家族成員Bmi-1對其更新和增殖的調(diào)控.pdf

1、目的：
　　腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是惡性腫瘤組織中發(fā)育等級較高，分化程度較低的一群細胞。腫瘤干細胞也被稱作腫瘤起始細胞（tumor initiating cells，TICs），具有自我更新、多向分化及高致瘤性等特點，與腫瘤的發(fā)生、耐藥、抗輻射及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Bonnet等首先在人類急性粒細胞白血病研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的存在，至今已在多種人類腫瘤中分離出腫瘤干細胞，包括乳腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、

2、卵巢癌、結(jié)腸癌以及肺癌。
　　最初分離肺癌干細胞（lung cancer stem cell,LCSCs）的方法是建立在細支氣管肺泡管交界處的正常肺部成體干細胞研究基礎(chǔ)上的，對它們功能的深入研究及發(fā)現(xiàn)特異性膜抗原標志物Sca及CD34的表達為分離肺癌干細胞提供了大量參考。Kim等于2005年在小鼠支氣管肺泡交界處分離出一群Sca+/CD34+雙陽性細胞，并發(fā)現(xiàn)這群細胞在k-ras癌基因激活的情況下，會導(dǎo)致小鼠肺腺癌的發(fā)生，此研究是

3、肺癌干細胞研究的里程碑。后來，Eramo等從肺癌病人組織標本成功分離共表達CD133+/EpCAM+的雙陽性細胞，經(jīng)鑒定被定義為人類肺癌干細胞。此外，還有其他研究者不通過表面標志物的方法，而利用Hochest染料分選側(cè)群細胞富集肺癌細胞系內(nèi)的肺癌干細胞。然而，這些方法都不能提供直接證據(jù)以評估肺癌干細胞在肺癌化療后復(fù)發(fā)中的作用。
　　本研究的主要內(nèi)容希望通過化療藥物篩選協(xié)同懸浮培養(yǎng)法富集耐藥肺癌干細胞，為研究肺癌干細胞在肺癌復(fù)發(fā)中的

4、作用提供體外模型。
　　肺癌是世界范圍內(nèi)影響人類健康的惡性腫瘤。雖然肺癌早期診斷和綜合治療的策略已經(jīng)使肺癌患者的生存期有所延長，但復(fù)發(fā)仍然是實現(xiàn)肺癌治愈的主要障礙。研究發(fā)現(xiàn)，30％-75％的肺癌患者手術(shù)切除及放化療后將復(fù)發(fā)。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤干細胞耐藥性和高致瘤性可能是化療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。腫瘤干細胞具有很強的自我更新及增殖潛力。有研究報道，僅僅10個腫瘤干細胞就能形成小鼠皮下移植瘤。顯然，一些調(diào)節(jié)干細胞自我更新和增殖的

5、信號通路在腫瘤干細胞內(nèi)存在異常。
　　在造血系統(tǒng)以及在其他正常組織中，成體干細胞進行不對稱分裂，分裂過程中一個子細胞保持干細胞特性，同時其他短暫擴充細胞（Tansient amplifying cells，TACs）則進入分化過程，TACs分化中進行對稱細胞分裂，產(chǎn)生具有相同“命運”的終末分化細胞。干細胞的自我更新過程是一個嚴格有序的步驟，但很可能在腫瘤及某些高增殖性疾病中被破壞。已經(jīng)表明，乳腺腫瘤干細胞在分裂過程中不是通過不對稱

6、分裂，而是采用對稱分裂的方式，加快了乳腺癌干細胞的自我更新和腫瘤發(fā)生的過程。
　　決定腫瘤干細胞自我更新能力及其分裂方式的因素或者基因還不甚明確。有效的方式是采用突變或者基因沉默干擾基因的表達，來研究目的基因?qū)δ[瘤干細胞分裂模式的作用，并觀察對腫瘤干細胞自我更新及致瘤能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控干細胞不對稱分裂的某些基因是抑癌基因（tumor suppressing gene，TSG）。在肺癌中經(jīng)常發(fā)生突變與沉默的抑制基因p53，有

7、促進乳腺成體干細胞不對稱分裂的作用，p53基因缺失能導(dǎo)致乳腺癌干細胞對稱分裂。這顯示了p53在決定腫瘤干細胞分裂模式及子代細胞命運的作用。p53基因是人類腫瘤中最頻繁突變的抑癌基因,細胞中p53表達水平受到MDM2的調(diào)控，MDM2可通過結(jié)合并抑制p53轉(zhuǎn)錄和促進p53蛋白的降解而調(diào)節(jié)p53的含量。INK4a/ARF(Inhibitor of cyclin-Dependent Kinase4a-Alternative Reading Fr

8、ame)是一個調(diào)控細胞周期并抑制細胞分裂的抑癌基因。INK4a/ARF編碼兩個司職細胞周期調(diào)控的蛋白p14~(ARF)和p16INK4a。p14~(ARF)能結(jié)合Mdm2,抑制Mdm2和p53相互作用,活化p53蛋白。Bmi-1(B-cell specific moloney leukemia virusin sertion site1)基因是多梳基因家族PcG(Polycomb group,PcG)中的重要成員之一,在調(diào)節(jié)干細胞自我更

9、新、細胞增殖和衰老中發(fā)揮重要作用。Bmi-1可負性調(diào)控p14~(ARF)的表達,通過p14~(ARF)-Mdm2-p53通路,影響p53的表達。
　　本研究采用順鉑體外化療誘導(dǎo)結(jié)合無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)的方法，從肺癌A549細胞中富集了一群自我分化能力強、高致瘤性的耐藥肺癌干細胞，發(fā)現(xiàn)耐藥肺癌干細胞中高表達Bmi-1，利用RNAi干擾沉默Bmi-1基因后，發(fā)現(xiàn)耐藥肺癌干細胞的自我更新、增殖能力降低，與此同時耐藥肺癌干細胞的分裂模式由

10、對稱分裂變?yōu)榉菍ΨQ分裂，抑制p53的表達能夠恢復(fù)對稱分裂。由此可見，Bmi-1通過p14ARF/MDM2/p53通路調(diào)控耐藥肺癌干細胞的自我更新的分裂模式，以影響耐藥肺癌干細胞在化療打擊后“干細胞池”擴增的過程。
　　除此之外，我們還報道了一種利用自體瘤內(nèi)成纖維細胞作為滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)人肺癌標本中CD133+/EpCAM+雙陽性細胞的方法。發(fā)現(xiàn)利用自體瘤內(nèi)成纖維細胞培養(yǎng)CD133+/EpCAM+雙陽性細胞能使CD133+/EpCAM

11、+雙陽性細胞增殖較快、細胞球體積更大并且能保持更好的未分化狀態(tài)。自體瘤內(nèi)成纖維干細胞由于能提供體內(nèi)相似細胞因子及微環(huán)境，因此能使肺癌干細胞在體外的培養(yǎng)下更能保持體內(nèi)的狀態(tài)。
　　研究方法：
　　1．自體瘤內(nèi)成纖維細胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)CD133+/EpCAM+雙陽性細胞
　　利用流式細胞儀分選3例肺癌手術(shù)標本中CD133+/EpCAM+雙陽性細胞，使用差速貼壁法并從相同病人的手術(shù)切除瘤灶中分離出自體瘤內(nèi)成纖維細胞。經(jīng)過3d

12、體外培養(yǎng)使CD133+/EpCAM+雙陽性細胞形成較小的細胞球后，轉(zhuǎn)移到自體瘤內(nèi)成纖維細胞滋養(yǎng)層上培養(yǎng)。對CD133+/EpCAM+雙陽性細胞在兩種培養(yǎng)條件下的增殖速度、未分化狀態(tài)、細胞多向分化及致瘤性等多方面進行比較。
　　2．從肺癌A549細胞中分離對順鉑耐藥肺癌干細胞并鑒定
　　順鉑體外誘導(dǎo)A549肺癌細胞株3 d，一小部分耐藥細胞存活。無血清培養(yǎng)用于選擇性“饑餓”非干細胞耐藥細胞，而干細胞則可在無血清培養(yǎng)基中球狀生長

13、。經(jīng)過3代細胞球培養(yǎng)，收集第三代球細胞并對其干細胞特性進行了鑒定，包括干細胞標記、自我更新能力、多向分化和異種移植瘤的形成。
　　3．Bmi-1基因在調(diào)控耐藥肺癌干細胞自我更新、增殖的作用
　　實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測肺癌干細胞中Bmi-1 mRNA和蛋白表達。設(shè)計針對Bmi-1的siRNA并利用慢病毒載體感染耐藥肺癌干細胞，獲得穩(wěn)定的Bmi-1敲低細胞系定義為dsLCSCsBmi1-。為了研究Bmi-1對耐藥肺癌干

14、細胞自我更新和增殖的影響，分別采用WST-1增殖實驗、細胞球形成實驗和異種移植瘤形成實驗觀察各組差異，并用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。
　　4．耐藥肺癌干細胞和dsLCSCsBmi1-分裂模式差異
　　利用PKH26染色和Numb蛋白的定位來觀察肺癌干細胞和dsLCSCsBmi1-的分裂模式。干細胞標記CD133的免疫熒光染色可以證實PKH26染色和Numb定位的結(jié)果。并利用p53特異性抑制劑，抑制p53表達初步探討B(tài)

15、mi-1下游分子p53在決定肺癌干細胞分裂模式中的作用。
　　研究結(jié)果：
　　1．從肺癌標本中分離出的CD133+/EpCAM+雙陽性細胞，在自體瘤內(nèi)成纖維細胞滋養(yǎng)層上生長狀態(tài)良好，細胞倍增時間約為41h-47 h。同時，這些細胞持續(xù)表達干細胞標記CD133并保持未分化狀態(tài)。免疫缺陷小鼠異體移植瘤形成和HE染色證明在滋養(yǎng)層上生長的CD133+/EpCAM+雙陽性細胞能保持其致瘤性和多向分化性。證明自體瘤內(nèi)成纖維細胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)

16、法與傳統(tǒng)的無血清培養(yǎng)基比較，能較好的保持干細胞的增殖活力與未分化狀態(tài)。
　　2．順鉑體外誘導(dǎo)A549細胞得到的順鉑耐藥細胞，定義為DSCs，通過無血清懸浮傳代培養(yǎng)，富集到一群能成球生長的耐藥A549細胞，定義為dsLCSCs。通過表面標志物CD133、ABCG2檢測、干細胞功能檢測等途徑鑒定這群細胞具有自我更新、多向分化和誘導(dǎo)異體移植瘤能力。流式檢測發(fā)現(xiàn)約0.5?1.3％的A549細胞為CD133陽性細胞，DSCs中~20％為CD

17、133陽性，相比之下>85％的dsLCSCs為CD133陽性。ABCG2的免疫熒光染色顯示，在相同的熒光強度背景下dsLCSCs熒光強度相較于DSCs和A549細胞中較強。自我更新實驗中，僅有1.63％的A549細胞能形成細胞球，有23.81％的DSCs和85.34％的dsLCSCs能形成細胞球。當dsLCSCs被血清誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)CK8和CK18標志物表達，證明了dsLCSCs的多向分化潛能。最重要的是，本實驗還發(fā)現(xiàn)dsLCSCs比D

18、SC和A549致瘤性更強。
　　3．dsLCSCs細胞中Bmi-1基因的mRNA和蛋白水平都高表達。利用RNAi沉默Bmi-1表達，發(fā)現(xiàn)dsLCSCs細胞增殖、自我更新、體外致瘤能力都降低。
　　4．Bmi-1能促進dsLCSCs細胞的對稱分裂，沉默Bmi-1誘導(dǎo)dsLCSCs細胞進行非對稱分裂。同時還證實了dsLCSCs中存在Bmi-1/p14ARF/MDM2/p53調(diào)控軸，發(fā)現(xiàn)通過p53抑制劑PFTα抑制p53表達，能重

19、建dsLCSCsBmi1-細胞的對稱分裂模式。
　　結(jié)論：
　　腫瘤干細胞可能是腫瘤復(fù)發(fā)的根源。為了研究腫瘤干細胞與化療后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系，我們建立體外模型來觀察耐藥肺癌干細胞增殖及自我更新的特點。并探討B(tài)mi-1基因在調(diào)控耐藥肺癌干細胞自我更新和分裂中的作用。結(jié)果證明通過順鉑誘導(dǎo)和無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)相結(jié)合，能夠選擇性地富集耐藥肺癌干細胞。Bmi-1基因在dsLCSCs中高表達，能促進dsLCSCs自我更新和增殖，而這種作用