hFXYD6蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及hFXYD6抗體對HepG2細(xì)胞生長的影響機(jī)制.pdf

1、探索肝癌的腫瘤標(biāo)志物及其生物治療靶點(diǎn)是提高肝癌診療療效的不可忽視關(guān)鍵因素。本課題組前期研究證實(shí)人FXYD6為膽管癌分化相關(guān)抗原，研制了兔抗人FXYD6抗體，發(fā)現(xiàn)FXYD6蛋白在膽管癌和胰腺癌組織有高水平的表達(dá)。為深入研究FXYD6基因蛋白在肝癌組織中的表達(dá)和FXYD6抗體對于肝癌細(xì)胞生長的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.觀察研究人FXYD6基因在正常肝臟、肝硬化組織和肝癌組織中的差異性表述，檢測該基因蛋白對于肝

2、癌的病理輔助診斷價(jià)值。
　　 2.探討抗人FXYD6抗體對HepG2肝癌細(xì)胞體外生長的影響及其機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.采用免疫組織化學(xué)染色方法顯示FXYD6蛋白在人正常肝臟(n=8)、癌旁的肝硬化組織和肝癌組織(n=40)中的表達(dá)，用組織切片自動(dòng)掃描分析儀(OlympusBX-61 U—PMTVC4M2532)聯(lián)合Applied Imaging軟件對FXYD6蛋白的表達(dá)進(jìn)行自動(dòng)定量分析。
　　 2

3、.采用葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測抗人FXYD6抗體對于人HepG2肝癌細(xì)胞體外生長的影響。采用Northern blot技術(shù)、Western blot技術(shù)探討FXYD6抗體對于肝癌細(xì)胞影響作用機(jī)制。
　　 3.統(tǒng)計(jì)處理時(shí)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用配對資料t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用EXCELL進(jìn)行均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差統(tǒng)計(jì)，用CHISS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)分析。P<0.05表示為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01表示差

4、異非常顯著。
　　 結(jié)果：
　　 1.FXYD6蛋白棕黃色染色顆粒位于胞膜和胞漿，以胞漿為主。FXYD6胞漿陽性細(xì)胞率在肝癌、肝硬化組織及正常肝臟組織依次顯著性的降低(p=0.000)。FXYD6蛋白的表達(dá)水平以細(xì)胞FXYD6蛋白陽性染色密度值表示，即FXYD6陽性細(xì)胞數(shù)百分率和著色胞漿密度的乘積，在肝癌組織、肝硬化組織和正常肝臟組織順次顯著性的降低(p=0.000)。
　　 2.細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的FXYD6抗體為1

5、：200時(shí)，葡萄糖消耗和MTT實(shí)驗(yàn)提示HepG2細(xì)胞的糖消耗和細(xì)胞生長均受到明顯的抑制。與對照組或FXYD6反義DNA組比較，F(xiàn)XYD6抗體能顯著的抑制HepG2細(xì)胞的增殖生長，F(xiàn)XYD6抗體聯(lián)合應(yīng)用FXYD6反義DNA對于HepG2細(xì)胞的抑制作用和FXYD6抗體的抑制作用無顯著性的區(qū)別。
　　 3.和含有FXYD6抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，HepG2細(xì)胞內(nèi)的Fxyd6mRNA的水平在培養(yǎng)后第3天明顯降低；Western印跡實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)

6、培養(yǎng)液中FXYD6抗體濃度為50μl/ml時(shí)，HepG2細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)的FXYD6蛋白明顯的低于其他處理組。
　　 結(jié)論：
　　 1.首次發(fā)現(xiàn)FXYD6與肝癌分化相關(guān)，從正常肝臟組織、肝硬化組織到肝癌組織，F(xiàn)XYD6蛋白表達(dá)量依次顯著性遞增。
　　 2.FXYD6抗體在適當(dāng)?shù)臐舛认履芤种企w外培養(yǎng)的HepG2肝癌細(xì)胞的糖消耗量，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和生長。但這種抑制作用無劑量一效應(yīng)關(guān)系。
　　 3.抗人FXYD