高遷移率族蛋白1在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用及丙酮酸乙酯的療效.pdf

1、再灌注治療雖然使缺血部位心肌血供得到恢復，但也可導致再灌注損傷。心肌缺血-再灌注損傷(IRI)的存在限制了再灌注治療效果。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、鈣超載均為心肌IRI的重要機制，但其始發(fā)因素及信號轉(zhuǎn)導機制尚未徹底闡明。為此，深入探討心肌IRI的分子調(diào)控機制及有效防治對策必將具有重要的臨床及理論價值。本研究利用大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，著重探討心肌缺血-再灌注后高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達及其與心肌IRI的關(guān)系，同時觀察丙酮酸乙酯干

2、預對心肌IRI的作用及分子機制，研究主要由四部分組成：①心肌缺血-再灌注后高遷移率族蛋白1的表達及其作用，②丙酮酸乙酯干預心肌缺血-再灌注損傷的劑量及時機，⑧高遷移率族蛋白1介導炎性缺血-再灌注損傷的機制及丙酮酸乙酯的作用，④丙酮酸乙酯對心肌缺血-再灌注后氧自由基及線粒體的影響。
　　 第一部分：心肌缺血再灌注后高遷移率族蛋白1的表達及其作用。
　　 目的：探討高遷移率族蛋白1(high mobility group b

3、ox1，HMGB1)在心肌缺血-再灌注后的時空表達特點；觀察外源性HMGB1對心肌缺血再灌注損傷的影響及其可能機制。
　　 方法：第Ⅰ部分：清潔級健康雄性SD大鼠分為5組，每組6只，分別于心肌缺血前、缺血30分鐘、再灌注30分鐘、再灌注24小時、再灌注48小時處死大鼠，留取標本檢測HMGB1的表達。第Ⅱ部分：清潔級健康雄性SD大鼠分為4組，每組6只，均給予缺血30分鐘，再灌注48小時：對照組(Control)，HMGB1-1μg

4、/kg組(HMGB1-1μg)，HMGB1-10μg/kg組(HMGB1-10μg)，HMGB1-100μg/kg組(HMGB1-100μg)，后3組在缺血再灌注后注射相應(yīng)劑量rhHMGB1。采用有創(chuàng)血流動力學檢測大鼠左心功能變化，TTC染色計算心肌梗死面積，免疫組化、Real-time PCR、Western Blot檢測HMGB1及其受體RAGE、TLR-2、TLR-4的表達。
　　 結(jié)果：第Ⅰ部分：在正常心肌組織中，HMG

5、B1蛋白定位于心肌細胞核內(nèi)；心肌缺血再灌注后，HMGB1陽性表達的細胞不僅位于心肌細胞核內(nèi)，而且大量表達于梗死區(qū)域內(nèi)的炎性細胞；HMGB1在大鼠心肌缺血30分鐘后顯著增高，并持續(xù)至再灌注48小時。第Ⅱ部分：與Control組相比，HMGB1-1μg組、HMGB1-10μg組心肌梗死面積、±dp/dt max、RAGE、TLR-2、TLR-4無顯著差界(P＞0.05)；但與Control組相比，HMGB1-100μg組心肌梗死面積顯著增大

6、(56.4±5.1％vs.44.6±3.7％，P＜0.05)，±dp/dt max顯著惡化(2199±185 mmHg/s vs.2890±217mmHg/s；1536±122mmHg/s vs.1979±190 mmHg/s；p＜0.05)；HMGB1、TNF-d及IL-6水平顯著增高，與Control組相比，HMGB1-100μg組RAGE、TLR-2、TLR-4水平明顯增高，其中以RAGE升高幅度最為明顯。
　　 結(jié)論：心

7、肌缺血再灌注后心肌及炎癥細胞胞核漿HMGB1表達顯著增高，外源性HMGB1進一步放大心肌炎癥反應(yīng)、增大梗死面積；HMGB1主要通過RAGE受體介導加重炎癥反應(yīng)及心肌損傷。
　　 第二部分：丙酮酸乙酯干預心肌缺血再灌注損傷的劑量及時機。
　　 目的：觀察不同劑量丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)對缺血-再灌注心肌的保護作用即量效關(guān)系研究；在合適的劑量下，探索其有效的治療窗口即時效關(guān)系研究。
　　 方法

8、：量效關(guān)系部分：清潔級健康雄性SD大鼠分為6組，每組6只，給予缺血30分鐘，再灌注48小時，具體分組如下：Control組、10mg/kg組、20mg/kg組、40mg/kg組、80mg/kg組、160mg/kg組。Control組給予乳酸林格斯液靜脈注射，其余各組均于缺血前2分鐘給予相應(yīng)劑量的EP靜脈注射。時效關(guān)系部分：清潔級健康雄性SD大鼠分為4個組，每組6只，給予缺血30分鐘，再灌注48小時，具體分組如下：Control組(缺血前

9、2分鐘給予乳酸林格斯液注射)，缺血前2分鐘給藥組(Is)，再灌注前2分鐘給藥組(R)，再灌注后30分鐘給藥組(R30)。除Control組外，其余各組均給予EP(40mg/kg)于相應(yīng)的時間點靜脈注射。采用有創(chuàng)血流動力學檢測大鼠左心功能變化，TTC染色計算心肌梗死面積。
　　 結(jié)果：在量效關(guān)系部分，與Control組相比，心梗面積在20mg/kg組就顯著減小(36.1±1.6％vs.45.9±4.2％，P＜0.05)，心功能顯著

10、改善，當劑量增加到40mg/kg時，心梗面積進一步減小(28.7±1.5％vs.45.9±4.2％，P＜0.05)，心功能進一步改善，當給藥劑量進一步增加到80mg/kg、160mg/kg時，心梗面積未見進一步減小。在時效關(guān)系部分，與Control組相比，Is組、R組均可顯著減少心肌梗死面積(29.0±2.5％，35.3±2.8 vs.46.4±3.8％，P＜0.05)，改善心功能；R30組心梗面積有減小趨勢，但無統(tǒng)計學差異(42.7±

11、3.4％vs.46.4±3.8％，P＞0.05)。
　　 結(jié)論：40mg/kg的EP是治療大鼠心肌缺血-再灌注損傷的最佳劑量；缺血前預先應(yīng)用EP的療效優(yōu)于再灌注即刻給藥，當給藥時問延遲到再灌注后30分鐘則EP的心肌保護作用消失；缺血前2分鐘至再灌注前2分鐘是EP保護心肌缺血-再灌注損傷的最佳時間窗。
　　 第三部分：HMGB1介導炎性缺血-再灌注損傷的機制及EP的作用。
　　 目的：觀察丙酮酸乙酯(EP)干預對炎

12、癥因子表達及炎癥性心肌缺血-再灌注損傷的影響；研究EP干預對心肌缺血-再灌注后炎癥因子表達變化的調(diào)控機制。
　　 方法：清潔級健康雄性SD大鼠分為4組，每組12只，均給予缺血30分鐘，再灌注48小時：1.假手術(shù)組(Sham)，只穿線不結(jié)扎；2.對照組(Control)，于再灌注前給予PBS0.5ml+RLS0.5ml靜脈注射；3.EP治療組(EP)，再灌注前2分鐘給予靜脈注射EP(40mg/kg)；4.EP+HMGB1組(EP+

13、HMGB1)：缺血再灌注前2分鐘靜脈注射EP(40mg/kg)+重組HMGB1(100μg/kg)。采用有創(chuàng)血流動力學檢測大鼠左心功能變化，TTC染色計算心肌梗死面積，ELISA法檢測血清HMGB1、TNF-d、IL-6，Western Blot檢測心肌磷酸化P38的表達。
　　 結(jié)果：與Sham組相比，Control組心肌梗死面積顯著增加，心功能顯著惡化，血清HMGB1、TNF-α、IL-6表達顯著增高，磷酸化P38水平顯著增

14、高(P＜0.05)；與Control組相比，給予EP治療后心肌梗死面積顯著下降(35.0±3.1％vs.45.7±3.5％，P＜0.05)，心功能明顯改善，HMGB1、TNF-d、IL-6及磷酸化P38水平顯著降低，而當HMGB1(100μg/kg)與EP同時給藥時，EP的心肌保護效益完全消失。
　　 結(jié)論：心肌缺血再灌注前給予適時適量EP能抑制炎癥因子HMGB1、TNF-α、IL-6的表達，減少炎性心肌缺血-再灌注損傷；同時給

15、予外源性HMGB1則可完全消除EP的心肌保護作用；EP通過影響HMGB1與受體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導通路關(guān)鍵蛋白p38的磷酸化、阻斷或降低HMGB1介導的促炎反應(yīng)及炎性心肌缺血-再灌注損傷。
　　 第四部分：丙酮酸乙酯對心肌缺血再灌注后氧自由基及線粒體的影響。
　　 目的：探討丙酮酸乙酯(EP)干預缺血再灌注損傷是否可影響氧自由基的代謝；觀察EP干預缺血再灌注損傷是否影響線粒體結(jié)構(gòu)與功能。
　　 方法：清潔級健康雄性S

16、D大鼠分為4個組，每組6只，給予缺血30分鐘，再灌注3小時：Sham組(冠脈只穿線不結(jié)扎)；Control組(再灌注前2分鐘給予RLS靜脈注射)；EP治療組(EP組，再灌注前2分鐘給予EP40mg/kg靜脈注射)。EP+蒼術(shù)苷組(EP+Atr組，EP40mg/kg加蒼術(shù)苷5mg/kg靜脈注射)。檢測大鼠左心功能變化，心肌梗死面積，心肌MDA、MPO、SOD水平，電鏡檢測心肌超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 結(jié)果：與Sham組相比，Contr

17、ol組心肌MDA(6.3±0.7 nmol/mg vs.1.6±0.3nmol/mg，P＜0.05)、MPO(0.35±0.04 U/g vs.0.95±0.12 U/g，P＜0.05)顯著升高，SOD顯著下降(65±10 U/mg vs.315±46 U/mg，P＜0.05)，線粒體受損明顯；與Control組相比，EP治療組顯著減小心肌梗死面積(44.5±4.5％vs.33.7±4.1％，P＜0.05)，抑制MDA(3.2±0.5

18、nmol/mg vs.control，P＜0.05)、MPO(0.67±0.06U/g vs.control，P＜0.05)增高，提升SOD水平(189±25 U/mg vs.control，P＜0.05)，減輕心肌線粒體損傷；當蒼術(shù)苷與EP同時給藥時，EP的心肌保護效益完全消失。
　　 結(jié)論：心肌缺血再灌注前予EP干預可抑制自由基生成、增加對其的清除能力；心肌缺血再灌注前予EP干預可抑制mPTP過度開放、減輕線粒體損傷；心肌缺