組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白細(xì)胞膜受體的分離鑒定與其抗腫瘤分子機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景
　　細(xì)胞因子的胞內(nèi)功能發(fā)揮,一般需要與細(xì)胞膜受體結(jié)合后經(jīng)特定信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行,或由受體介導(dǎo)入胞后發(fā)揮其生物學(xué)活性。Kallistatin(Kal)是一種組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白,也是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,具有多種生物學(xué)功能,如降血壓、舒張血管、抗炎、抗氧化、抗纖維化、促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成、抑制血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)等。目前發(fā)現(xiàn)的Kal膜受體有肝素硫酸蛋白聚糖(HSPGs),介導(dǎo)Kal的抗新生血管生成作用;有低密度脂蛋白受體相

2、關(guān)蛋白6(LRP6),介導(dǎo)Kal的抗腫瘤作用;還有Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子4( Kruppel-like factor4,KLF4),介導(dǎo)Kal的抗炎作用。這三個(gè)Kal受體的發(fā)現(xiàn),在一定程度上解釋了Kal部分功能,但尚不足以闡釋Kal的多功能特點(diǎn)。我們判斷蛋白,Kal的多功能應(yīng)該是多靶點(diǎn)多通路作用的結(jié)果,應(yīng)該還有未被發(fā)現(xiàn)的Kal膜受體。
　　研究目的
　　分離、鑒定Kal細(xì)胞膜結(jié)合蛋白,驗(yàn)證細(xì)胞膜結(jié)合蛋白在Kal抗血管生成和

3、抗腫瘤中的作用,為揭示Kal的多功能性以及涉及的分子機(jī)制等奠定基礎(chǔ)。
　　研究方法
　　(1)制備重組人Kal(rhKal),利用Pull-Down、LC-MC/MC、免疫共沉淀、免疫熒光等技術(shù)分離、鑒定rhKal細(xì)胞膜結(jié)合蛋白。
　　(2)利用siRNA、抗體封閉等技術(shù),分析rhKal膜結(jié)合蛋白在rhKal抗血管生成和抗腫瘤作用中的作用。
　　(3)利用流式細(xì)胞儀、Western Blotting等方法,分析細(xì)

4、胞膜結(jié)合蛋白對(duì)介導(dǎo)rhKal入胞的作用。
　　(4)采用細(xì)胞培養(yǎng)及分析方法,分析rhKal與候選rhKal細(xì)胞膜結(jié)合蛋白所涉及的信號(hào)通路。
　　(5)利用皮下移植瘤模型,分析候選rhKal細(xì)胞膜結(jié)合蛋白介導(dǎo)rhKal的抗血管生成和抗腫瘤活性的分子機(jī)制。
　　研究結(jié)果
　　(1)首次發(fā)現(xiàn)核仁素、整合素β3、金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(VEGFR1)、VEGFR2為rhKal細(xì)胞膜結(jié)合蛋白。

5、
　　(2)首次發(fā)現(xiàn)核仁素是介導(dǎo)rhKal入胞的重要受體,并參與rhKal體內(nèi)外抗腫瘤新生血管形成的過(guò)程。
　　(3)首次發(fā)現(xiàn)核仁素介導(dǎo)rhKal抗血管生成的分子機(jī)制是:rhKal通過(guò)而下調(diào)蛋白激酶CK2的表達(dá)抑制核仁素磷酸化,從而抑制由VEGF和堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　(4)首次發(fā)現(xiàn)整合素β3可以介導(dǎo)rhKal的抗腫瘤活性。
　　(5)首次發(fā)現(xiàn)整合素β3介導(dǎo)rhKal抗腫瘤