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文檔簡(jiǎn)介
1、心血管疾病是威脅人類生存和影響生存質(zhì)量的重要疾病,在發(fā)達(dá)國(guó)家,心血管疾病已經(jīng)超過腫瘤,成為威脅人類生存的第一殺手。心血管疾病往往伴隨動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,而在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中,血中膽固醇水平的改變被認(rèn)為是重要的始動(dòng)因素。因此,研究膽固醇的代謝,對(duì)于理解動(dòng)脈粥樣硬化有重要意義。
ACAT是脂酰輔酶A膽固醇?;D(zhuǎn)移酶(acyl-coA cholesterol acyltransferase),催化膽固醇和脂酰輔酶A生成膽
2、固醇酯,加上的脂肪酸烴鏈?zhǔn)鼓懝檀减サ氖杷暂^游離性膽固醇的疏水性大大增加,分子間可以通過疏水性相互作用大量堆積在一起,極大地增加了堆積密度。ACAT分為ACAT1型和ACAT2型。ACAT1幾乎在所有組織中有表達(dá),而ACAT2只在肝腸組織中表達(dá)。ACAT2催化的膽固醇酯由于有很強(qiáng)的疏水性,在肝中可以與甘油三酯,ApoB組裝成VLDL顆粒并分泌到血中。ACAT2被認(rèn)為與血中LDL中的膽固醇酯水平緊密相關(guān):在細(xì)胞水平,ACAT2在肝細(xì)胞的過
3、表達(dá)可以促進(jìn)VLDL和ApoB的分泌;在動(dòng)物水平ACAT2來源的膽固醇酯被認(rèn)為是血液中致動(dòng)脈粥樣硬化的主要酯類,ACAT2的敲除鼠肝臟中VLDL和ApoB的分泌減少,血液中膽固醇酯水平明顯降低,并且對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化有抵抗作用;通過寡核苷酸的方法干擾小鼠肝臟ACAT2之后,ApoB的分泌減少,血液中膽固醇酯顯著降低,小鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊抵抗能力增強(qiáng)。因此,ACAT2被認(rèn)為是很有潛力的治療靶點(diǎn)?;贏CAT2對(duì)于膽固醇代謝的明確作用,研究
4、ACAT2的調(diào)控具有重要意義。雖然已經(jīng)知道ACAT2可以受到膽固醇別構(gòu)效應(yīng)的調(diào)節(jié),但是,關(guān)于ACAT2是否受到不同因素引起的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,還沒有報(bào)道。為了觀察不同的飲食和營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)于膽固醇酯代謝的調(diào)節(jié)作用,我們對(duì)ACAT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了研究。
首先,我們構(gòu)建了ACAT2的報(bào)告基因,通過觀測(cè)其在肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性,我們發(fā)現(xiàn)ACAT2的啟動(dòng)子在非肝細(xì)胞中本底轉(zhuǎn)錄水平很低,這與其啟動(dòng)子上不含經(jīng)典的TATA box相一致
5、;在肝細(xì)胞中ACAT2的轉(zhuǎn)錄活性主要受肝特異性因子調(diào)控。通過構(gòu)建一系列截短的啟動(dòng)子的報(bào)告基因并在肝細(xì)胞和非肝細(xì)胞中觀察活性,我們發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)可能的HNF4的結(jié)合位點(diǎn)。通過報(bào)告基因,我們發(fā)現(xiàn)HNF4可以增加ACAT2啟動(dòng)子的活性。通過構(gòu)建結(jié)合位點(diǎn)突變的報(bào)告基因,以及通過EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn),我們證實(shí)了HNF4可以通過這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合到ACAT2的啟動(dòng)子上發(fā)揮作用。這兩個(gè)位點(diǎn)中,位點(diǎn)Ⅰ在-780~-790bp的位置,位點(diǎn)Ⅱ在-20~-30bp
6、的位置,位點(diǎn)Ⅱ的突變導(dǎo)致報(bào)告基因的活性完全缺失,與PGL3-Basic相當(dāng),我們認(rèn)為HNF4可能通過該位點(diǎn)維持基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平,而通過位點(diǎn)Ⅰ增強(qiáng)ACAT2的表達(dá)。另外,通過腺病毒過表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)HNF4可以顯著上調(diào)ACAT2的表達(dá),而在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的HNF4干擾的穩(wěn)定克隆細(xì)胞系中,ACAT2顯著下調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了HNF4對(duì)ACAT2具有上調(diào)作用。
脂肪酸可以分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。這兩類脂肪酸對(duì)于膽固醇代謝的影響已有
7、很多研究。一般認(rèn)為,飽和脂肪酸可以顯著上調(diào)血液中LDL-膽固醇的含量。脂肪酸可以作為HNF4的配體發(fā)揮作用,因此我們?cè)O(shè)想飽和脂肪酸調(diào)節(jié)ACAT2,進(jìn)而通過改變ACAT2的表達(dá)量影響到膽固醇的代謝。為了觀察飽和脂肪酸處理細(xì)胞對(duì)ACAT2表達(dá)的影響,我們選用生理狀態(tài)下飽和脂肪酸含量最高的棕櫚酸處理人肝細(xì)胞系HepG2和HuH7和原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)棕櫚酸非常明顯地上調(diào)ACAT2的表達(dá),而在對(duì)照BSA組和不飽和脂肪酸油酸處理組,ACAT
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