GATA4和HNF4α介導的人臍帶間充質(zhì)干細胞向肝細胞定向分化的研究.pdf

1、肝細胞是肝臟生理功能的主要執(zhí)行者，在基礎(chǔ)研究，藥物研發(fā)及肝病細胞治療中具有重要的應(yīng)用價值，然而肝細胞來源短缺的狀況嚴重地制約著相關(guān)領(lǐng)域的研究進展，并阻礙了其臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的進程。因此，探索如何獲取大量、純凈、健康、合格的肝細胞具有非常重要的意義。由于直接分離的原代肝細胞培養(yǎng)相對困難且供體來源短缺，因此從易于培養(yǎng)的細胞誘導獲得功能性肝（樣）細胞成為國內(nèi)外的研究熱點。目前這方面的研究取得了顯著進展，但是由于某些不可避免的局限性，這些誘導起始細

2、胞或誘導策略各有優(yōu)劣。其中，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)不僅具有干細胞的特性，而且來源豐富、取材方便、擴增迅速，還具有更低的免疫原性及一定的肝源性，成為目前理想的誘導性肝樣細胞來源。本研究借鑒體細胞直接轉(zhuǎn)分化為肝樣細胞的誘導策略，采用慢病毒介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將肝富集轉(zhuǎn)錄因子GATA4和HNF4α轉(zhuǎn)入hUC-MSCs中，進行肝細胞方向的定向誘

3、導分化，取得了較好的結(jié)果。
　　本研究利用組織塊貼壁培養(yǎng)法，從臍帶基質(zhì)分離獲得了生長性狀穩(wěn)定，均質(zhì)性良好的hUC-MSCs。在組織塊貼壁培養(yǎng)3～4d時，觀察到組織塊間隙有小三角形或紡錘形細胞鋪展開來，培養(yǎng)至第7d時取出組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)一周左右，細胞匯合至約90％時進行傳代。傳代后，細胞約4h貼壁，2d后迅速生長，呈現(xiàn)典型的成纖維細胞樣形態(tài)，具有清晰的輪廓及內(nèi)部應(yīng)力纖維，多為星形或紡錘形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細胞核呈卵圓形，核仁大而明顯;

4、當細胞基本達到完全匯合時，呈平行排列或漩渦生長。通過細胞免疫熒光染色鑒定分離獲得的細胞幾乎全部為CD44陽性。
　　本研究以上述分離、鑒定的hUC-MSCs為誘導肝細胞的起始細胞。利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將包含GATA4或HNF4α的慢病毒表達載體和包裝系統(tǒng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入HEK293T細胞，制備重組慢病毒。用兩種重組慢病毒侵染P6代的hUC-MSCs，在侵染后約兩周，可觀察到表達GFP的、具有典型上皮樣細胞形態(tài)的的肝樣細胞克隆，其體積較小，細

5、胞核較大，有1～3個核仁，呈小三角形或不規(guī)則形上皮樣，大多數(shù)細胞有胞質(zhì)突起。通過RT-PCR檢測到，hUC-MSCs本身表達部分肝系基因CK19、EpCAM、CK18、ALB、G6P、GLUL和MET;而誘導細胞除表達上述基因外，與誘導前的hUC-MSCs相比，開啟了TAT的表達，抑制了IL6的表達;功能檢測顯示部分誘導細胞具有成熟肝細胞攝取與排泌ICG的功能。
　　綜上結(jié)果表明，本研究從臍帶基質(zhì)獲得了具有肝源性的hUC-MSCs