人TGFb3、CTGF和TIMPl基因重組慢病毒多表達質(zhì)粒的構(gòu)建及活性檢測.pdf

1、目的:構(gòu)建人轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGFβ3)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP1)基因重組慢病毒多表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后檢測活性、包裝病毒并探討其作用特點。
　　 方法:應(yīng)用全基因合成技術(shù),以“自剪切多肽2A”串聯(lián)目的基因,并克隆到慢病毒表達質(zhì)粒構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-TGFβ3-P2A-CTGF-T2A-TIMP1。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后,應(yīng)用RT-PCR和Western-Blot技術(shù)分別檢測轉(zhuǎn)染后

2、不同時間點目的基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。
　　 結(jié)果:RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示重組質(zhì)粒成功表達了目的基因并于轉(zhuǎn)染后48小時左右達到峰值,“2A”結(jié)構(gòu)下游基因蛋白質(zhì)表達量約為上游基因的80%。經(jīng)慢病毒包裝后獲得5×108TU/ml滴度的活性病毒。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了攜帶人TGFβ3、CTGF和TIMP1基因的慢病毒多表達質(zhì)粒并收獲較高滴度的活性病毒,為轉(zhuǎn)染椎間盤髓核細(xì)胞和動物實驗打下