MDM2 SNP309多態(tài)性位點(diǎn)在急性髓系白血病的發(fā)生危險(xiǎn)度的作用及對(duì)化療藥物敏感性的影響.pdf

1、第一部分： 研究目的：在50％以上的人類腫瘤組織中均檢測(cè)到p53抑癌基因的突變。因此，p53介導(dǎo)的通路中重要基因的遺傳變異將會(huì)影響個(gè)體的腫瘤易感性。p53受MDM2蛋白的精密調(diào)控，該蛋白是p53通路中的一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。已知MDM2和p53基因上存在一些SNP位點(diǎn)，其中位于啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MDM2 SNP309T>G位點(diǎn)和位于編碼區(qū)的p53第72位密碼子備受關(guān)注。MDM2基因的SNP309位點(diǎn)的變異可提高M(jìn)DM2的mRNA和蛋

2、白質(zhì)表達(dá)水平，從而減弱p53的腫瘤抑制作用。而p53基因的第72位密碼子具有CGC/CCC多態(tài)性，使編碼的精氨酸(Arg)被脯氨酸(Pro)取代。研究還發(fā)現(xiàn)這二個(gè)SNP位點(diǎn)都與腫瘤的遺傳易感性、癌變的演進(jìn)及預(yù)后有關(guān)。本文探討了MDM2 SNP309和p53第72位密碼子多態(tài)性與急性髓系白血病的關(guān)系。 研究方法：采用等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(AS-PCR，allele—specific polymerase chain rea

3、ction)和聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR—RFLP，polymerase chain reaction—based restriction fragment length polymorphism)檢測(cè)231例急性髓系白血病病人及128例正常人的MDM2SNP309和p53第72位密碼子多態(tài)性的基因分型。擬和優(yōu)化x2檢驗(yàn)分析正常人基因分布頻率是否符合Hardy—Weinberg平衡。用非參數(shù)檢驗(yàn)分析病人MDM2和p53的

4、基因分型與各種臨床特征(年齡、性別、細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)、起始白血病計(jì)數(shù)等)的關(guān)聯(lián)，以非條件Logistic回歸模型計(jì)算表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比(odds rations，OR)及其95％可信區(qū)間(confidential interval，CI)，OR值以年齡校正。對(duì)基因—基因交互作用的進(jìn)一步分析采用基于相乘模型的叉生分析法，交互效應(yīng)(OR)即為基因和基因聯(lián)合作用效應(yīng)。以P<0.05定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

5、分析。 結(jié)果：正常人群MDM2和p53基因型頻率分布符合Hardy—Weinberg平衡。在急性髓系白血病組中，攜帶MDM2 SNP309 GG基因型的頻率(33.2％)顯著高于正常對(duì)照組(19.5％)，與SNP309 TT基因型相比，攜帶SNP309 GG基因型可增加急性髓系白血病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)年齡校正后的OR值為(OR=3.52，95％CI=1.80-6.87)。MDM2和p53的各種基因型在急性髓系白血病人群的臨床特征均無

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。叉生分析顯示，MDM2和p53兩基因型對(duì)急性髓性白血病的發(fā)病并無交互作用。 結(jié)論：MDM2 SNP309 GG等位基因可能對(duì)急性髓系白血病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)起作用。 第二部分： 研究目的：DNR和VP—16在白血病治療中發(fā)揮重要的作用。許多細(xì)胞周期調(diào)控蛋白都參與了VP—16誘導(dǎo)的凋亡。比如在臍帶CD34陽性細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p53、C—Myc和BAFF參與VP—16誘導(dǎo)的凋亡并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。VP—16可通過p53

7、途徑或獨(dú)立于p53的途徑來阻斷G2→M期。DNR也通過復(fù)雜的信號(hào)途徑促進(jìn)凋亡和細(xì)胞死亡。本研究的目的就是闡明是否MDM2 SNP309位點(diǎn)的改變會(huì)影響白血病細(xì)胞系對(duì)化療藥物的耐藥性。 研究方法：通過PCR擴(kuò)增以及測(cè)序技術(shù)鑒定白血病細(xì)胞系的MDM2 SNP309基因多態(tài)性以及p53的突變情況。分別用DNR和VP—16對(duì)白血病細(xì)胞系進(jìn)行藥物處理，通過MTT的方法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞系的增殖能力的影響。通過DNA ladder電泳分析以及A

8、nnexin V法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞系的凋亡的影響。 結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)MDM2 SNP位點(diǎn)的改變并不影響白血病細(xì)胞系的增殖能力，然而，DNA ladder電泳分析顯示攜帶MDM2 SNP309的TT基因型的白血病細(xì)胞系對(duì)DNR和VP—16誘導(dǎo)的凋亡更敏感。 結(jié)論：MDM2 SNP309位點(diǎn)可能通過凋亡途徑影響白血病細(xì)胞系對(duì)化療藥物的敏感性。 第三部分： 研究目的：觀察AML1和AML1—ETO融合基因?qū)Σ煌?/p>

9、SNP309位點(diǎn)MDM2 P2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，探討AML1—ETO促進(jìn)白血病發(fā)生的機(jī)制。 研究方法：構(gòu)建含不同SNP309位點(diǎn)的MDM2 P2啟動(dòng)子的報(bào)告質(zhì)粒，與AML1—ETO、AML1以及SP1的表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染CV—1細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶的活性，分析AML1—ETO、AML1以及SP1對(duì)MDM2 P2啟動(dòng)子的影響。 結(jié)果：在CV—1細(xì)胞中，AML1—ETO在一定濃度范圍(50-500ng)內(nèi)，pGL3—MD

10、M2G—Basic載體相對(duì)于pGL3—MDM2T—Basic載體的Luciferase表達(dá)量有1.2—4倍的降低。而AML1對(duì)不同的SNP309位點(diǎn)的MDM2 P2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用并無顯著性差別。將AML1—ETO與固定劑量的SP1分別與含有不同的SNP309位點(diǎn)的MDM2 P2啟動(dòng)子報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)SNP309 GG啟動(dòng)子的報(bào)告基因的Luciferase表達(dá)量明顯下調(diào)，且沒有劑量依賴性。而SNP309 TT啟動(dòng)子的報(bào)告基因