Neuritin重組腺相關病毒2修復大鼠受損視神經(jīng)的作用及機制.pdf

1、目的:
　　視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其特殊的解剖生理特性成為研究中樞神經(jīng)損傷和再生的理想部位。研究視神經(jīng)損傷后的再生，不僅對視神經(jīng)損傷的治療，同時也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷后的治療及功能恢復有著重要的意義。臨床上治療視神經(jīng)損傷的方法主要有藥物治療、視神經(jīng)管減壓手術、電針和針灸等，但受損神經(jīng)難以再生。視神經(jīng)損傷后會引起視網(wǎng)膜節(jié)細胞(RGCs)的逐漸凋亡、內在再生能力低下及軸突的再生抑制性微環(huán)境等問題。目前促進受損視神經(jīng)再

2、生的方法主要有:周圍神經(jīng)移植、細胞移植、添加神經(jīng)營養(yǎng)因子和基因治療等;找準靶分子，應用基因治療視神經(jīng)損傷是近年來研究的熱點，極富應用前景。重組腺相關病毒2(AAV2)是用于眼部最安全、合適的載體，且研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)突起素（Neuritin，Nrn1）具有獨特的神經(jīng)營養(yǎng)作用。本課題采用大鼠的視神經(jīng)壓榨傷模型，以Nrn1為靶分子，研究Nrn1對視神經(jīng)損傷后RGCs存活和軸突再生的作用及機制。
　　方法:
　　(1)構建Neuriti

3、n重組腺相關病毒2質粒并包裝測定其滴度。
　　(2)玻璃體注射及視神經(jīng)壓榨傷模型制作:用微量注射器吸取按照每只眼球2μl的rAAV2-EGFP、rAAV2-Nrn1-EGFP或者生理鹽水注射到大鼠的玻璃體腔，4周后用Yasargil動脈瘤夾在大鼠視神經(jīng)眼球后2mm處夾傷9s，2周后經(jīng)心臟灌注取材。
　　(3)采用免疫熒光組織化學檢測rAAV2在視網(wǎng)膜中轉染細胞的類型以及轉染RGCs的效率。
　　(4)采用Real-ti

4、me PCR和Western blot檢測Nrn1在各組視網(wǎng)膜中mRNA和蛋白的表達變化。
　　(5)采用HE染色、免疫組織化學、CTB追蹤和TUNEL檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對RGCs存活、凋亡的作用。
　　(6)采用RITC標記和透射電鏡檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對視神經(jīng)軸突再生的作用。
　　(7)采用瞳孔對光反射和閃光視覺誘發(fā)電位檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對視覺功能恢復的作用。

5、r>　　(8)采用Western blot檢測視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細胞內信號轉導通路關鍵分子pAkt1、pAkt2、pErk1/2和pStat3表達的作用，同時檢測對細胞凋亡相關分子Bcl-2和Bax、Caspase3和Cleaved Caspase3表達的作用。
　　結果:
　　(1)成功構建Neuritin重組腺相關病毒2的質粒，測得的rAAV2-EGFP病毒滴度為2.24×1012vg/ml，rAAV2-

6、Nrn1-EGFP病毒滴度為2.34×1012vg/ml。
　　(2)成功注射Neuritin重組腺相關病毒2，4周后視網(wǎng)膜鋪片結果顯示視網(wǎng)膜大部分細胞和神經(jīng)纖維表達綠色熒光;免疫熒光組織化學結果顯示rAAV2-EGFP轉染約70％的RGCs，且?guī)缀醪晦D染RGCs層的星形膠質細胞。
　　(3)成功在視網(wǎng)膜內過表達Nrn1，Real-time PCR和Western blot結果顯示rAAV2-Nrn1-EGFP組中Nrn1

7、mRNA和蛋白含量分別約為rAAV2-EGFP組的19倍和2.3倍; ONC/rAAV2-Nrn1-EGFP組Nrn1 mRNA和蛋白含量分別約為ONC/rAAV2-EGFP組的6倍和2倍。
　　(4)視網(wǎng)膜Nrn1過表達對RGCs存活、視神經(jīng)軸突再生和視覺功能恢復的作用:HE染色結果顯示RGCs層細胞存活數(shù)量增多，gamma synuclein免疫組織化學和CTB追蹤結果顯示RGCs的存活數(shù)量增加，TUNEL檢測結果顯示RGCs

8、層的細胞凋亡數(shù)量明顯減少;RITC標記視神經(jīng)結果顯示存留和再生的軸突顯著增加，透射電鏡結果顯示大部分軸突的髓鞘板層保持緊致，少許稍有松散和變寬;瞳孔對光反射結果顯示瞳孔從最大縮小至最小時直徑的比值明顯減小，閃光視覺誘發(fā)電位結果顯示P波的潛伏期時間縮短、振幅增強。
　　(5)視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細胞內信號轉導通路關鍵分子表達的作用:Westernblot結果顯示同時上調pAkt1和pStat3表達，而對pAkt2和pErk1/2均

9、無明顯作用。視網(wǎng)膜Nrn1過表達對細胞存活相關分子表達的作用:Western blot結果顯示視網(wǎng)膜中Bcl-2表達上調、Bax表達下調，Caspase3和Cleaved Caspase3表達下調。
　　結論:
　　(1)玻璃體注射rAAV2-EGFP后，主要轉染視網(wǎng)膜中約70％的RGCs，幾乎不轉染RGCs層的星形膠質細胞。
　　(2)玻璃體注射rAAV2-Nrn1-EGFP后，Nrn1在視網(wǎng)膜內過表達。