靛玉紅對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的影響及在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的應(yīng)用研究.pdf

1、機體對自身抗原的免疫耐受機制有克隆缺失、免疫無能和免疫忽視，此外機體還通過調(diào)節(jié)性T細胞以“主動”方式實現(xiàn)自身免疫耐受。大量動物實驗證實，這群調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的數(shù)目減少或功能失調(diào)均可引起自身免疫性疾病。而臨床也已有多種自身免疫性病在急性期和難治復(fù)發(fā)的患者中觀察到調(diào)節(jié)性T細胞的減少和抑制功能下降，而在緩解期的患者調(diào)節(jié)性T細胞的水平則有所回升。 特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic p

2、urpura，ITP)是一種血小板特異性自身免疫性出血性疾病。由于自身免疫耐受被打破，引起體液免疫和細胞免疫紊亂，產(chǎn)生抗自身血小板抗體或激活血小板特異性細胞毒性T細胞/NK細胞，引起血小板在單核巨噬細胞系統(tǒng)被破壞。 目前導(dǎo)致ITP發(fā)生的機制尚不十分明確，大量研究證實涉及多個環(huán)節(jié)的免疫紊亂：包括產(chǎn)生大量的血小板膜糖蛋白特異性自身抗體，與血小板形成免疫復(fù)合物，在單核巨噬細胞系統(tǒng)(RAS)被吞噬破壞； Thl細胞增多、Th2細胞減少，

3、相應(yīng)細胞因子分泌紊亂；共刺激信號系統(tǒng)異常；骨髓巨核細胞超微結(jié)構(gòu)異常；樹突狀細胞功能過度增強等等。最新研究證實ITP患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)性T細胞明顯少于正常志愿者，在疾病恢復(fù)時顯著回升，為研究ITP的發(fā)病機制和進展特點提供了新的思路。 靛玉紅可以抑制包括細胞周期依賴蛋白酶(CDK)在內(nèi)的多種蛋白酶，從而對實驗性實體瘤具有廣譜抑制增殖的功能，同時有研究證實了靛玉紅在抗炎抗病毒及治療自身免疫病上的應(yīng)用潛力。我們首次嘗試用靛玉紅治療ITP小鼠

4、，明顯改善了血小板減少的臨床癥狀，并對其作用機制進行了進一步探討。 我們應(yīng)用Wastar大鼠血小板注入CBA小鼠，成功構(gòu)建了ITP模型，并證實了該模型的種系差異性。實驗證明靛玉紅能有效地改善ITP小鼠的血小板減少，而這種作用存在顯著的劑量依賴性。對于治療機制的探討，我們首先進行了體外對脾細胞增殖和凋亡的檢測，發(fā)現(xiàn)靛玉紅對小鼠的脾細胞有明顯的抑制作用，同時可以增加脾細胞的凋亡。通過正常Balb/C小鼠的體內(nèi)試驗，我們觀察到靛玉紅能

5、顯著提高脾及胸腺的CD4<'+>CD25<'high>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的相對比率，而其它大多數(shù)細胞的比例則是明顯降低的。雖然靛玉紅能明顯抑制同種異基因或絲裂原刺激的CD4<'+>T細胞的反應(yīng)，但是靛玉紅處理后小鼠的CD4<'+>CD25<'high>調(diào)節(jié)性T細胞在體內(nèi)外的抑制功能均沒有明顯變化。 Foxp3作為一個特異的轉(zhuǎn)錄因子主要表達在CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞中，是調(diào)節(jié)性T細胞的一個特異表面標志。在CD

6、4<'+>CD25<'->T細胞內(nèi)特異表達Foxp3能使這些細胞轉(zhuǎn)變成同固有調(diào)節(jié)性T細胞功能和表型相似的CD4<'+>CD25<'+>調(diào)節(jié)性T細胞。所以，我們檢測了脾，淋巴結(jié)，胸腺內(nèi)Foxp3的表達，發(fā)現(xiàn)靛玉紅處理后Foxp3表達沒有改變，同時脾細胞表面CD4<+>CD25<'high>調(diào)節(jié)性T細胞的其它表面分子的表達也沒有顯著改變。我們分離靛玉紅處理組和對照組小鼠的脾細胞中的CD4<'+>CD25<'high>調(diào)節(jié)性T細胞，通過體外混

7、合淋巴細胞培養(yǎng)來檢測功能，結(jié)果表明靛玉紅處理組的CD4<'+>CD25<'high>調(diào)節(jié)性T細胞同對照組的細胞都具有免疫抑制功能，并且這兩者之間沒有統(tǒng)計學差異。 我們的體內(nèi)試驗表明靛玉紅能相對提高CD4<'+>CD25<'high>FoxP3<,+>調(diào)節(jié)性T細胞的比例但是降低其的數(shù)量，表明在這個體內(nèi)模型中，靛玉紅并沒有擴增外周調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量。而同CD4<'+>CD<'->25T細胞比較，靛玉紅更少的誘導(dǎo)CD4<'+>CD25

8、<'high>調(diào)節(jié)性T細胞死亡。 我們進一步對ITP小鼠的調(diào)節(jié)性T細胞進行了檢測，觀察到靛玉紅顯著提高了外周血，淋巴結(jié)和脾的CD4<'+>CD25<'high>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的相對比率，而其它各亞群的比例則出現(xiàn)明顯降低。且靛玉紅處理后小鼠的CD4<'+>CD25<'high>調(diào)節(jié)性T細胞在體內(nèi)外仍具有良好的抑制功能，與對照組間沒有顯著差異。而這種對外周淋巴組織的影響較正常Balb/C更為明顯。而其他的表面標志則沒

9、有顯著性變化。同時我們還可以觀察到靛玉紅處理的ITP小鼠，其胸腺的CD4<'+>CD25<'high>Foxp3<'+>調(diào)節(jié)性T細胞的相對比例升高，證實靛玉紅在中樞淋巴器官也可以更優(yōu)先誘導(dǎo)反應(yīng)性T細胞的凋亡，提示靛玉紅在誘導(dǎo)中樞免疫耐受的具有潛在價值。 此外靛玉紅與正常Balb/C小鼠的脾臟巨噬細胞體外共培養(yǎng)，可觀察到巨噬細胞吞噬雞紅細胞和細菌的能力明顯減弱。而ITP小鼠的用藥組，分離其脾臟巨噬細胞，與自身和同種異基因小鼠的血小

10、板共孵育，結(jié)果顯示靛玉紅處理過的ITP小鼠的脾臟巨噬細胞對血小板的吞噬明顯減少。提示靛玉紅能夠非特異的影響巨噬細胞的吞噬功能。 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞發(fā)揮抑制效應(yīng)主要是通過細胞與細胞之間的直接接觸來發(fā)揮作用的，同時調(diào)節(jié)性T細胞的比例對于炎癥和自身免疫性疾病的抑制以及誘導(dǎo)腫瘤抗原的耐受都是極為重要的。我們通過靛玉紅能夠相對提高正常小鼠和ITP中調(diào)節(jié)性T細胞的比例，而不影響其抑制功能，了解了其在調(diào)節(jié)免疫和治療自身免疫性疾病中