小鼠精原細胞與精母細胞miRNA差異表達及功能研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸,在物種間廣泛分布并高度保守的非編碼小分子RNA。miRNA通常以不完全互補方式識別結(jié)合mRNA的3’端非翻譯區(qū),進而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負調(diào)控作用。其作用形式包括介導(dǎo)靶mRNA降解或翻譯抑制。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA參與細胞周期、細胞分化及腫瘤形成等多種生物過程。miRNA在表達上具有時空特異性,該特點使其與發(fā)育及分化過程密切相關(guān)。
　　 精子發(fā)生是指精原細胞經(jīng)過細胞增殖、減數(shù)分裂及精

2、子細胞形成三個階段最終分化為單倍體成熟精子的周期性多級分化發(fā)育過程。以小鼠為例,其精原細胞首見于出生后第6天,約2天后出現(xiàn)B型精原細胞,并在第10天出現(xiàn)前細線期精母細胞,而圓形精子細胞的出現(xiàn)則需要20天,其第一波精子發(fā)生過程大約持續(xù)35天。
　　 眾所周知,發(fā)育過程涉及一系列轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的基因表達調(diào)控,而miRNA作為新涌現(xiàn)出來的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子自發(fā)現(xiàn)以來倍受研究學(xué)者們的關(guān)注。近年來,有關(guān)miRNA在精子發(fā)生中的作用已迅速成為男性

3、生殖領(lǐng)域研究的熱點。例如,miR—122a主要在晚期生精細胞中表達并通過降解靶mRNA的方式抑制過渡蛋白2(TransitionProtein2,Tnp2)的表達,而后者作為圓形精子細胞的一個標志物參與減數(shù)分裂后期的染色質(zhì)重塑,提示miR-122a在減數(shù)分裂后期生精細胞中發(fā)揮重要作用。最近的研究表明miR-34c可通過增強生精細胞特異標志物的表達進而促進晚期精子發(fā)生。
　　 本實驗室保有的兩個生精細胞系GC-1 spg和GC-2

4、 spd分別代表B型精原細胞及減數(shù)分裂前期精母細胞。兩者在精子發(fā)生中可視為減數(shù)分裂前的兩個連續(xù)的細胞分化時相,準確地說兩者處于由有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)變的過渡階段。對其進行表達譜分析可能有助于詮釋精子發(fā)生中減數(shù)分裂的發(fā)生機制。本研究中,我們通過miRNA芯片技術(shù)對GC-1與GC-2細胞中的miRNA進行差異表達分析。分析數(shù)據(jù)結(jié)果并按GC-1/GC-2表達比值>2或<0.5篩選差異表達的miRNA,從中發(fā)現(xiàn)20個表達下調(diào)、8個表達上調(diào)的候選

5、miRNA。通過real time PCR法驗證芯片結(jié)果,我們鑒定了4個GC-1細胞高表達的miRNA,分別是miR-15a、miR-125a-5p、miR—184及miR-468。
　　 應(yīng)用miRanda、TargetScan及PicTar等生物信息學(xué)軟件對上述候選miRNA進行靶基因預(yù)測,并通過雙熒光素酶報告基因分析對預(yù)測的靶基因進行篩選,結(jié)果顯示在眾多預(yù)測靶基因中,僅miR-15a的一個潛在靶基因Ccnt2可以引起熒光素

6、酶活性的顯著降低。
　　 作為miR-15a/miR-16-1基因簇的一員,miR-15a一直被視為重要的腫瘤抑制因子,并通過特異性靶向各種致癌基因而與抑制細胞增殖、促進凋亡及抑制腫瘤發(fā)生密切相關(guān),其表達下調(diào)見于多種癌癥。
　　 Cyclin T2(Ccnt2)是近十年來新發(fā)現(xiàn)的T型Cyclin家族的一員,包含兩個選擇性剪接體(Cyclin T2a與Cyclin T2b),并在組織之間廣泛表達。Cyclin T2與CDK

7、9共同組成異源二聚體復(fù)合物P-TEFb(positive transcription elongation factor b)并通過磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ)羧基末端結(jié)構(gòu)域(carboxyl-terminal domain,CTD)進而促進轉(zhuǎn)錄延伸。通常認為,該復(fù)合物發(fā)揮作用并不依賴細胞周期進程。目前,Ccnt2的功能尚不十分清楚,已明確的是其在肌細胞分化中具有重要意義。
　　 通過對8株

8、小鼠細胞系進行Ccnt2及miR-15a的表達譜分析,我們發(fā)現(xiàn)兩者之間存在表達上的互反關(guān)系。對Ccnt2潛在靶位點的保守性分析顯示其在物種之間高度保守。為了驗證miR-15a與Ccnt2之間的關(guān)系,我們對Ccnt2潛在靶位點進行了突變體報告基因分析,結(jié)果顯示miR-15a可直接調(diào)控Ccnt2且位于miR-15a3’端的堿基配對對于其識別Ccnt2更加重要。此外,Western blot結(jié)果顯示應(yīng)用miR-15a模擬物(mimic)或抑制

9、物(inhibitor)轉(zhuǎn)染GC-1細胞可分別明顯降低或增加Ccnt2的表達量；進一步的拯救實驗結(jié)果表明Ccnt2 siRNA可明顯抑制Ccnt2表達,而此抑制作用可被miR-15a inhibitor恢復(fù),從而證明Ccnt2是miR—15a的直接靶基因。
　　 鑒于CDK9/Ccnt2復(fù)合物參與肌細胞分化過程,我們設(shè)想miR-15a可能參與調(diào)節(jié)該過程,并利用可誘導(dǎo)分化的小鼠成肌細胞模型C2C12進行后續(xù)研究。利用miR-15a

10、 mimic或Ccnt2 siRNA轉(zhuǎn)染C2C12細胞,real time PCR結(jié)果表明唯有miR-15a mimic處理組過表達miR-15a,且siRNA與miR-15a均可使Ccnt2 mRNA表達降低,提示miR-15a通過降解途徑抑制Ccnt2表達。之后對轉(zhuǎn)染miR-15a的C2C12細胞進行誘導(dǎo)分化,并在不同時間點上觀察早期分化標志物(myogenin)及晚期分化標志物(myosin heavy chain,MHC)的表達

11、變化。結(jié)果顯示隨著分化進程,myogenin及MHC的表達量均連續(xù)增加,而Ccnt2的表達量卻逐漸降低,提示Ccnt2對細胞分化的起始階段有重要作用。與對照組相比,miR-15a處理組中myogenin及MHC的表達量均減少;而從細胞形態(tài)上看,miR-15a對肌管形成有明顯抑制作用。由此可見,miR-15a通過靶向Ccnt2進而對成肌細胞的分化起負調(diào)控作用。
　　 由于缺乏生精細胞分化的體外模型,難以直接觀察到Ccnt2及miR

12、-15a對生精細胞分化的影響,因而我們收集發(fā)育中的小鼠睪丸,并在不同水平上對兩者的表達情況進行檢測。Real time PCR結(jié)果顯示,Ccnt2 mRNA在出生后3周內(nèi)連續(xù)增加并在第4周突然降低,提示其對早期精子發(fā)生意義重大.而Western blot結(jié)果顯示,Ccnt2較大的剪接體(小鼠的Cyclin T2a)在第3周時表達量突然升高,隨后基本穩(wěn)定;而較小的剪接體(小鼠的Cyclin T2b)則在第3周時表達量突然降低,之后變化也不

13、大,提示Ccnt2的兩個剪接體在睪丸發(fā)育的不同階段分別發(fā)揮主要作用。對miR-15a的平行檢測表明,miR-15a在出生后,尤其是出生后3周內(nèi)連續(xù)降低,在表達上與Ccnt2恰好相反。因此,Ccnt2與miR-15a可能在早期精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
　　 綜上所述,我們鑒定了4個在小鼠減數(shù)分裂前生精細胞中差異表達的miRNA,預(yù)測并證實Ccnt2是miR-15a的一個直接靶基因。同時,我們首次報道m(xù)iR-15a通過靶向Ccnt2