TGF-β3與牙髓干細胞在動物面神經損傷修復中的應用研究.pdf

1、目的：
　　面神經的損傷在臨床上較為常見，且損傷后很少能達到完美的功能恢復，嚴重影響患者及家屬的心身健康及生活質量。隨著干細胞研究的深入，利用骨髓干細胞對脊髓和顱腦損傷的治療頻頻見于文獻報道，但利用干細胞進行外周神經損傷的治療報道較少。本研究旨在通過動物實驗和分子生物學技術觀察DPSCs與TGF-β3聯(lián)合干預對于面神經損傷的修復效果，并探討其作用機制，為治療面神經損傷提供新的方法。
　　方法：
　?。?）從新西蘭幼兔前

2、牙及磨牙牙髓組織中分離DPSCs進行體外培養(yǎng)，測定細胞克隆形成率、生長曲線、細胞爬片行HE染色、抗Vimentin、抗osteonectin、抗DSP、抗CD44免疫組化染色，鑒定DPSCs的增殖能力和多分化潛能的生物學特征。
　　（2）12只普通級瞬目反射正常的成年健康新西蘭大白兔，面部兩側自身對照，隨機分為自身正常對照組和上頰支缺損模型組，各組l2側。于建模后7d、14d分別行光鏡、電鏡組織病理學檢測，結合動物行為學觀察、神經

3、電生理檢測技術對面神經上頰支缺損模型進行評價。
　?。?）成年健康新西蘭大白兔48只（共96側面神經），隨機抽取24只（共48側面神經）右側設為TGF-β3+DPSCs實驗組（共24側面神經），左側設為TGF-β3對照組1組（共24側面神經），另外24只新西蘭大白兔（共48側面神經）右側設為正常對照組（共24側面神經），左側設為PBS對照組2（共24側面神經），分別制作面神經上頰支7mm缺損、損傷局部硅膠管套接的動物模型。于術后1

4、周、1月、3月分別行大體形態(tài)、光鏡、電鏡組織學觀察、神經電生理檢測、GFAP和S100免疫組織化學染色等檢測。
　　結果：
　　第一部分：1）原代培養(yǎng)的幼兔牙髓細胞多呈成纖維細胞樣細胞，少數紡錘形或多角形，光鏡下傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)特點與原代培養(yǎng)無明顯差異；從第1代到第3胞活率細胞數比分別為：94.7％、95.8%、95.2%；牙髓干細胞在低密度接種后能夠形成克隆，幼兔牙髓細胞克隆集落形成率為10-21個/103細胞；2）幼兔

5、牙髓細胞體外多次傳代仍具有良好的增殖能力，24孔板計數法表明兔牙髓細胞潛伏期短，隨后進入對數增長期，選取的第三代細胞均在五天達到對數生長期，約在第8天細胞達到平臺期；細胞周期的測定結果為：G1期DNA含量占80.4%；G2期DNA含量占15.3%；S期DNA含量占4.3%；3）原代和次代克隆，免疫細胞化學對未經誘導的細胞進行表面標志物Vimentin、CD44、osteonectin、dsp鑒定，結果均為染色陽性。
　　第二部分：

6、1）12只實驗動物建模過程均較順利，術中面神經暴露良好，操作可重復性佳。切口均獲得I期愈合，動物在研究期間未發(fā)生切口感染及并發(fā)癥，無實驗兔死亡，動物存活率100%，建模成功率達100%；2）建模后所有實驗動物術側均出現(xiàn)面神經麻痹癥狀，2周時術側面部輕度萎縮，兔唇明顯偏向健側；術后2周面部胡須運動功能評分，術側分值為0.25±0.05，與健側分值4分比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-249.16，P＜0.05）；3）面神經電生理檢測結果顯示，

7、建模后1周、2周時，實驗兔健側組正常面神經潛伏期為（1.47±0.42）ms，神經動作電位最大波幅為（11.32±5.36）mV；刺激術側組面神經中樞側斷端，不能引起同側上唇方肌收縮；實驗兔術側面神經動作電位均未能引出；4）健側組面神經HE染色可見，正常面神經上頰支纖維呈長條形，排列整齊，髓鞘密集，無退變，神經外膜連續(xù)；手術組面神經斷端可見神經纖維連續(xù)性中斷，斷端部分脫髓鞘改變，神經外膜松散，神經纖維腫脹，板狀層結構疏松，軸突呈空泡狀；

8、5）電鏡觀察顯示，正常面神經軸突排列整齊，均勻一致，髓鞘結構完整、厚度較均勻、呈致密板層排列，胞核清晰；術后1周模型組神經鞘膜解離，板狀結構變得模糊以致消失形成橢圓形小體，出現(xiàn)神經纖維球，軸漿內呈低電子密度；術后2周模型組軸突明顯腫脹，其內微管、微絲數目明顯減少，線粒體腫脹呈空泡樣，電子密度降低；神經纖維排列紊亂，神經外膜連續(xù)性中斷板層脫離。
　　第三部分：1）術后3月大體形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組1、2比較，實驗組再生神經直徑與近、

9、遠端神經干相當，無神經瘤形成，外膜血管豐富，質地堅韌；2） HE染色，術后3月實驗組神經纖維排列較整齊，胞核濃密，束間血管多；對照組1神經纖維萎縮，再生神經纖維較少，扭曲較明顯，呈盤旋狀；對照組2部分軸突消失，神經纖維排列紊亂、髓鞘厚薄不均；3）電鏡結果顯示實驗組的再生纖維以有髓神經纖維為主，形態(tài)規(guī)則，髓鞘板層結構清晰，軸漿內細胞器豐富；對照組1再生纖維髓鞘發(fā)育稍差，有髓神經纖維形態(tài)較規(guī)則，軸漿內細胞器較豐富；對照組2再生纖維髓鞘發(fā)育不

10、良，板層結構紊亂，有髓神經纖維形態(tài)不規(guī)則，可見到變性的神經纖維；4）圖像分析顯示，實驗組再生神經纖維總數多于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組再生神經纖維直徑遠遠大于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組再生神經髓鞘厚度遠遠大于其他兩個對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；5）神經電生理檢測顯示，實驗組神經肌肉動作電位的潛伏期明顯短于其他兩個對照組[實驗組（1.96±0.32）ms，對照組1（

11、2.35±0.41） ms，對照組2（3.42±0.55）ms，P＜0.05]，而實驗組神經肌肉動作電位的波幅明顯高于其他兩個對照組[實驗組（11.06±3.25）mv，對照組1（8.40±1.68）mv，對照組2（4.62±0.77）mv，P＜005]；6）免疫組化結果顯示，各處理組面神經核中均出現(xiàn)GFAP陽性細胞，且術后7天GFAP陽性細胞數TGF-β3+DPSCs實驗組＞TGF-β3對照組1＞PBS對照組2（P＜0.05）；各處理

12、組面神經中均出現(xiàn)S100陽性細胞，且S100陽性細胞數 TGF-β3+DPSCs實驗組＞TGF-β3對照組1＞PBS對照組2（P＜0.05）。
　　結論：
　?。?）本研究所培養(yǎng)的DPSCs增殖能力強，具有穩(wěn)定的生物活性，可適應長期大量培養(yǎng)的需要。
　?。?）在傳代第一代、第二代及第三代形成的克隆細胞率最高，可以選擇前三代形成的克隆球進行細胞移植治療。
　　（3）本研究建立的兔面神經上頰支缺損動物模型，制作簡便、