人臍帶源基質干細胞的轉分化及在脊髓損傷修復中的應用研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是最嚴重的創(chuàng)傷之一,但同時也是治愈率最低、死亡率最高的疾病之一。隨著現(xiàn)代建筑業(yè)、交通運輸業(yè)的發(fā)展,SCI的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢,傳統(tǒng)的治療方法包括手術、藥物、康復理療和功能鍛煉等,但是療效都不理想。盡管如此,目前已開發(fā)出幾種可能取得突破的治療策略,并在動物模型上獲得初步的成功,細胞移植就是其中最有應用前景的治療手段之一。
　　 已有多種類型的細胞被嘗試應用于動物模型和臨床

2、Ⅰ、Ⅱ期隨機實驗中。胚胎干細胞和中樞來源的神經(jīng)干細胞雖在理論上有較高的評價,但用于異體移植有較大免疫排斥反應,并且存在倫理上的限制。雪旺氏細胞和嗅鞘細胞療效也得到肯定,但受取材和擴增能力的限制,也不適宜用于臨床。成體基質干細胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)取材方便容易,體外易于大量擴增,有免疫抑制功能,不受倫理道德影響,并可做基因的良好載體,因此,應用MSCs有望成為臨床治療SCI的首選種子細胞。

3、>　　 本研究以人臍帶基質干細胞(umbilical cord stromal cells,HUMSCs)為種子細胞,首先建立分離和培養(yǎng)HUMSCs的方法,全面了解其生物學特性及向骨,軟骨和脂肪細胞的分化潛能:其次在體外建立誘導HUMSCs向神經(jīng)干細胞(Neural stem cells,NSCs)分化的方法,并對HUMSC轉分化而來的神經(jīng)干細胞(HUMSC-NSCs)進行功能學鑒定；接下來,誘導HUMSC-NSCs向神經(jīng)細胞、少突膠

4、質前體細胞和雪旺氏細胞定向分化,并對分化而來的細胞進行形態(tài)學、細胞表型和功能學鑒定；然后對HUMSCs和HBMSCs的生物學特征進行全面比較,為SCI體內治療種子細胞的篩選提供依據(jù)；最后聯(lián)合PLGA多孔支架和HUMSCs-NSCs治療大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察其療效,并對其作用機制進行探討。本論文包括五個章節(jié):
　　 第一章 人臍帶基質細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:建立分離培養(yǎng)人臍帶基質干細胞(HUMSCs)的方法,

5、充分了解其生物學特性。
　　 方法:采用膠原酶消化法獲得HUMSCs,并對細胞的一般形態(tài)、免疫表型、細胞周期、擴增能力以及向骨、軟骨和脂肪細胞的多向分化能力進行鑒定。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤((X)±SE)來表示,并應用SPSS13.0軟件進行分析,用析因方差分析對P1和P25之間的細胞生長曲線進行統(tǒng)計學分析。用單因素ANOVA檢驗及LSD多重比較對第1-8代HUMSCs之間的倍增時間進行統(tǒng)計學分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意

6、義。
　　 結論:通過本研究,我們成功建立了分離培養(yǎng)HUMSCs的可靠方法。HUMSCs并具有較強的體外擴增能力,細胞免疫表型與典型MSCs相似,具有成脂、成骨、成軟骨的多向分化潛能,是一種理想的成體干細胞來源。
　　 第二章 人臍帶基質細胞向神經(jīng)干細胞的轉分化研究
　　 目的:建立HUMSCs向神經(jīng)干細胞分化的方法,并對HUMSC轉分化而來的神經(jīng)干細胞(HUMSC-NSCs)進行形態(tài)學、組織學和功能學鑒定,為N

7、SCs臨床移植治療SCI的研究提供無倫理道德爭議的細胞來源。
　　 方法:用表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)和N2對HUMSCs進行預誘導；比較預誘導和未經(jīng)誘導的HUMSCs向神經(jīng)干細胞方向分化的效率。然后用人成纖維生長因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2,FGF2),表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)以及

8、b27將預誘導后的HUMSCs向神經(jīng)干細胞方向分化。然后用免疫熒光化學、western blot對HUMSC-NSCs進行組織學鑒定,最后把HUMSC-NSCs和人胚胎來源的NSCs向神經(jīng)細胞分化的能力進行比較。用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行處理,采用成組t檢驗比較HUMSCs和預誘導HUMSCs誘導而來的神經(jīng)球平均直徑和nestin陽性表達率,用單因素ANOVA及LSD多重比較定量分析HUMSC-NSCs的細胞倍增時間,以及未

9、分化HUMSCs,HUMSC-NSCs和終極分化的HUMSC-NSCs之間重要干細胞功能基因的表達,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:通過本實驗成功建立了誘導HUMSCs向NSCs分化的方案,HUMSC-NSCs具備大部分神經(jīng)系統(tǒng)來源NSCs的典型特征,為NSCs用于臨床移植治療SCI解決了來源問題。但HUMSC-NSCs與中樞神經(jīng)來源的NSCs尚存在一定差別,當前的方案仍需要進一步改進。
　　 第三章 人

10、臍帶基質細胞源神經(jīng)干細胞的分化研究
　　 目的:建立HUMSC-NSCs向神經(jīng)細胞、雪旺氏細胞(Schwann cells,SCs)和少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)定向誘導分化的方法,為HUMSCs的多向分化潛能提供依據(jù),并為HUMSCs未來用于SCI后的神經(jīng)再生和髓鞘再生修復提供細胞來源。
　　 方法:通過建立不同的誘導培養(yǎng)基,將HUMSC-NSCs誘導為神

11、經(jīng)細胞、SCs和OPCs,并以周圍神經(jīng)來源的SCs、胚胎來源的膠質前體細胞(hESC-OPCs)為對照,對轉化而來的細胞進行形態(tài)學、組織學和功能學鑒定。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤表示((X)±SE)。用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行處理,用配對t、成組t檢驗和單因素ANOVA及LSD多重比較的方法進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:這些誘導而來的細胞在形態(tài)學和組織學上與“真正的”神經(jīng)元、雪旺氏細胞

12、或少突膠質前體細胞無異,但在功能學上均存在不同程度的差別。HUMSC-NSCs有向神經(jīng)細胞、雪旺氏細胞和少突膠質前體細胞定向分化的潛能,盡管具備一定的功能學特征,但目前的誘導方案不能保證HUMSC-NSCs分化而來的神經(jīng)細胞、雪旺氏細胞和少突膠質前體細胞的長期穩(wěn)定性。
　　 第四章 人臍帶基質細胞與人骨髓基質細胞生物學特性的比較研究
　　 目的:在體外對HUMSCs和HBMSCs在形態(tài)學、細胞的擴增能力、向神經(jīng)細胞的分化

13、能力、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)的分泌以及免疫抑制能力方面進行詳細的比較學研究,為臨床種子細胞的篩選提供依據(jù)。
　　 方法:在細胞形態(tài)學方面,用光鏡和電鏡對HUMSCs和HBMSCs進行觀察和比較；在細胞的體外擴增能力方面,我們對細胞的擴增曲線、倍增時間和細胞周期進行分析和比較；在向神經(jīng)干細胞分化的能力方面,我們對骨髓源和臍帶源干細胞的擴增能力和自我更新能力進行了分析和比較；在分泌NTFs方面,我們用基因芯片對86個NTFs基因進

14、行分析,然后對代表性差異的NTFs進行組織化學染色鑒定芯片結果。最后用PCR和免疫組織化學對免疫相關的細胞因子進行分析。
　　 結論:HUMSCs是HBMSCs理想的替代來源,將成為未來治療SCI最有潛力的MSCs之一。
　　 第五章 組織工程化人臍帶基質干細胞源神經(jīng)干細胞移植治療成年大鼠脊髓全橫斷損傷的研究
　　 目的:組織工程技術治療SCI的基本模式為“種子細胞+生物支架”。基于前面研究基礎上,我們以HUMS

15、C-NSCs為種子細胞,以PLGA大孔支架為生物材料聯(lián)合治療大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察其療效。同時以HBMSCs-NSCs為對照,比較二者在動物模型體內的移植效果。
　　 方法:在體外構建成年大鼠脊髓全橫斷損傷模型,將負載有細胞或生理鹽水的PLGA大孔支架移植于脊髓橫斷處。實驗動物隨機分為A組:HUMSC-NSCs+PLGA組,B組:HBMSC-NSCs+PLGA組；C組:HUMSC-NSCs組；D:生理鹽水+PLGA組；E:假手

16、術組。主要從運動功能評價(BBB評分、爬格子實驗),組織形態(tài)學修復(大體形態(tài)學比較、HE染色、空洞修復)、移植細胞在體內的存活和分化(BrdU以及神經(jīng)細胞標記物免疫組織化學染色分析),軸突再生(NF-200,5-HT、TH、CGRP纖維再生情況,神經(jīng)束路逆行和順性追蹤觀察皮質脊髓束纖維和背索上行感覺神經(jīng)纖維的再生情況)這幾方面進行分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤表示((X)±SE)。用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行處理,以P<0.0

17、5為差異有統(tǒng)計學意義。對BBB評分和爬格子實驗采用重復測量的ANOVA分析和LSD多重比較,其他數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA分析和LSD多重比較。
　　 結論:以HUMSC-NSCs為種子細胞聯(lián)合PLGA支架的治療策略,顯著促進了脊髓全橫斷損傷后大鼠的軸突再生和功能修復,且HUMSC-NSCs+PLGA治療組的療效明顯好于HBMSC-NSCs+PLGA治療組,但細胞的替代作用和皮質脊髓束纖維再生顯然不能解釋相對顯著的功能恢復,HU