人類OTX2基因突變對IRBP與POU1F1基因啟動子活性的影響.pdf

1、目的：先天性小眼球和無眼球是一類以眼球前后徑小于正常范圍或眶內(nèi)眼組織完全缺如為特征的先天性眼發(fā)育異常性疾病,遺傳方式包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X連鎖隱性遺傳等。在我國,小眼球的發(fā)病率為11.8/10萬,其中75%-90%為散發(fā)病例。先天性眼盲病例中16.6%患有小眼球或無眼球,是我國兒童失明的主要原因之一。近年來,人類配對盒PAX6、SRY相關(guān)高遷移率集團(tuán)2SOX2和正小齒同源物2OTX2等轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因被確定為先天性

2、小眼球和無眼球的主要致病基因。
　　 人類OTX2基因定位于染色體14q22.23區(qū),共包含3個(gè)外顯子,編碼由289個(gè)氨基酸構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子。OTX2包含N末端結(jié)構(gòu)域(1～21aa),1個(gè)高度保守的同源結(jié)構(gòu)域(38～100aa)和C末端轉(zhuǎn)錄激活域(153～235aa)。其中高度保守的同源結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA結(jié)合域,可形成螺旋一轉(zhuǎn)角一螺旋結(jié)構(gòu),與DNA序列相結(jié)合。OTX2在發(fā)育的視泡中廣泛表達(dá),在指導(dǎo)視泡外翻與外胚層接觸過程中起重要作用。

3、動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Otx2在小鼠腦發(fā)育階段表達(dá)于間腦、中腦以及端腦的腹背區(qū)域,并對視網(wǎng)膜色素上皮的分化起關(guān)鍵作用。
　　 OTX2轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合到DNA序列上,改變相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。受OTX2調(diào)控的基因包括光間受體視黃類物質(zhì)結(jié)合蛋白IRBP(IRBP),Ⅰ級POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子ⅠPOU1F1(POUdomain,classⅠ,transcription factorⅠ,POU1F1),ES細(xì)胞表達(dá)同源盒l(wèi)HES

4、XI(Homcobox,ES cell expressed1,HESX1),BEST1(bestrophin1),促性腺激素釋放激素1GNRH1(gonadotropin-releasing hormonel,GNRH1)等,其中IRBP與眼發(fā)育相關(guān),而POU1F1則與垂體功能相關(guān)。
　　 本課題前期在一漢族家系中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的錯(cuò)義突變c.203G＞C,該突變位于DNA結(jié)合域的編碼序列,導(dǎo)致蛋白質(zhì)p.Arg68Pro改變。通過對不

5、同物種OTX2蛋白序列的對比,發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)高度保守。為了明確該區(qū)域的功能,本研究擬定點(diǎn)突變保守區(qū)域的65位和7l位氨基酸,并選取文獻(xiàn)報(bào)道的7種未進(jìn)行功能鑒定的突變位點(diǎn),構(gòu)建突變型OTX2表達(dá)載體,將OTX2表達(dá)載體與.IRBP/POU1F1啟動子區(qū)熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,檢測下游基因IRBP和POU1F1啟動子區(qū)載體的熒光素酶活性,以初步鑒定上述突變的功能。
　　 材料與方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)材料:人胚

6、腎細(xì)胞系HEK293;細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑;TA克隆載體pMD18-T;DUAL-GLOTM雙熒光素酶檢測系統(tǒng)等。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法:突變型OTX2表達(dá)載體構(gòu)建及測序;軟件預(yù)測突變型OTX2蛋白三維構(gòu)象;與pGL3-IRBP和pGL3-POtJ1F1載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞;熒光素酶活性檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建了9種OTX2突變的表達(dá)載體并進(jìn)行了測序驗(yàn)證;
　　 2.對突變型OTX2蛋白的

7、三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測;
　　 3.野生型OTX2可使IRBP轉(zhuǎn)錄活性提高約8.75倍,7種突變型OTX2則降低了IRBP的啟動子轉(zhuǎn)錄活性(*P＜0.05)。與野生型OTX2相比,p.Ile65Asp和p.Va171Glu均使下游基因轉(zhuǎn)錄活性下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4.野生型OTX2可使POU1F1轉(zhuǎn)錄活性提高約7.5倍,7種突變型OTX2則降低了POU1F1啟動子轉(zhuǎn)錄活性(*P＜0.05)。與野生