胰腺癌發(fā)病中Hedgehog-Gli1信號通路效應MicroRNAs的篩選與鑒定.pdf

1、第一部分、胰腺癌HH信號通路核轉錄因子Gli1的效應miRNAs的篩選
　　目的:應用Affymetrix miRNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技術對胰腺癌細胞中提取的總RNA進行檢測，差異篩選得到HH信號通路核轉錄因子Gli1的候選效應miRNAs，在此基礎上篩選獲得候選效應miRNA的靶基因集合。
　　方法:參加檢測的RNA分別來源于胰腺癌SW1990和Panc-1細胞，實驗組為SW1990細胞轉染G

2、il1過表達載體和Panc-1細胞轉染Gil1過表達載體，對照組為SW1990細胞和Panc-1細胞，對兩組實驗共12個RNA樣本進行檢測，后續(xù)根據(jù)檢測相關系數(shù)與P值進行差異篩選，獲得候選效應miRNAs和相應效應miRNAs的靶基因集合。
　　結果:
　　1.RNA樣品質檢合格。
　　2.Affymetrix miRNA2.0芯片質量控制結果合格。
　　3.Affymetrix HTA3.0芯片樣品質控合格;芯

3、片質量及雜交情況可靠。
　　4.獲得具有Gli1結合位點的效應miRNAs3個即has-mir-301a-3p，has-mir-29b-1-5p，has-mir-1228-3p。5.獲得效應miRNAs的正負相關靶基因集合。
　　結論:在Affymetrix miRNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技術的輔助下，準確、高效、完整地為我們提供了HH-Gil1的效應miRNAs及其相應靶基因集合，為我們后續(xù)研究奠

4、定了扎實的基礎。
　　第二部分、胰腺癌HH信號通路核轉錄因子Gli1的效應miRNAs的鑒定
　　目的:應用染色體免疫共沉淀反應聯(lián)合熒光定量聚合酶鏈式反應(ChIP-QPCR)的實驗方法驗HH-Gli1能與證候選效應miRNAs的啟動子序列結合;并構建Gli1過表達載體，驗證Gli1高表達時相應候選效應miRNAs也高表達，從而進一步證實候選效應miRNAs是Gli1的直接效應miRNAs。
　　方法:構建Gli1過表

5、達載體，轉染SW1990胰腺癌細胞，以此作為實驗組，SW1990細胞為對照組，展開ChIP-QPCR實驗，其中實驗組和對照組的實驗又分為實驗組（應用抗Gli1抗體）、陰參組(兔 IgG)、陽參組（應用抗RNA聚合酶Ⅱ抗體）和input組，經細胞裂解、超聲破碎、抗體孵育、洗脫純化后得到的DNA片段進行PCR檢測，最終結果均以input的百分比表示，各自比較Gli1組與陰參組之間的差異，并將實驗組與對照組的Gli1組進行比較，得到兩組之間樣

6、品比值;構建Gli1過表達載體，轉染SW1990胰腺癌細胞，以未轉染組作為對照，檢測相應效應miRNAs表達情況。
　　結果:
　　1.構建Gli1過表達載體成功。
　　2.轉染Gli1基因成功的SW1990胰腺癌細胞（實驗組）與SW1990細胞（對照組）分別進行ChIP-QPCR，最終對照組的3個效應miRNAs（即miR-301a，miR-29b-1，miR-1228）的Gli1組與IgG組相比，差異無統(tǒng)計學意義(

7、P＞0.05)，而實驗組的3個效應miRNAs(即miR-301a，miR-29b-1,miR-1228)的Gli1組與IgG組相比，有差異且均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　3.三組效應miRNAs(miR-301a，miR-29b-1，miR-1228)的實驗組與對照組的Gli1組比較，實驗組均有不同水平的升高，分別是對照組的3倍，2.7倍和2倍。
　　4.轉染過表達Gli1載體的SW1990細胞中提取總RNA，檢測