2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、分泌型Hedgehog(Hh)家族在脊椎動物和非脊椎動物的胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。脊椎動物Hh信號功能的缺失導(dǎo)致很多發(fā)育畸形,包括前腦無裂畸形、多指/趾畸形、顱面缺損和骨骼形成缺損。同時,Hh信號通路的異常激活也與很多類型的人類惡性腫瘤有關(guān),如腦膠質(zhì)瘤、髓母細胞瘤、食管癌、直腸癌、小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌。因此全面了解Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機制,不僅可以闡明胚胎發(fā)育的分子機制,同時也可以預(yù)防和治療Hh相關(guān)的腫瘤。
 

2、  在脊椎動物,Hh配體與細胞表面的受體Patched(Ptch)結(jié)合,這一結(jié)合可阻止Ptch對Smoothened(Smo)蛋白的抑制,從而允許Hh通路得以激活。Hh信號通路有3個Gli轉(zhuǎn)錄因子對其進行調(diào)節(jié):Glil、Gli2、Gli3。其中,Gli2、Gli3具備雙重轉(zhuǎn)錄活性,在有Hh信號存在時為激活狀態(tài)(Gli2A/Gli3A),在無Hh信號時經(jīng)蛋白酶水解加工成為抑制狀態(tài)(Gli2R/Gli3R)。Gli1是Gli2A/Gli3

3、A的直接作用轉(zhuǎn)錄基因,只具有激活子功能。Gli2是調(diào)節(jié)Hh信號通路的主要的轉(zhuǎn)錄激活子。目前,Hh信號和蛋白修飾物如何調(diào)節(jié)Gli蛋白的功能尚未得到完全了解。
   小泛素樣修飾蛋白(Sumo)是一個有100個氨基酸的多肽,可通過與泛素化類似的方式與靶蛋白共價結(jié)合。Sumo修飾對靶蛋白的功能有多種效應(yīng)。比如,轉(zhuǎn)錄因子Sumo化修飾之后大多會使轉(zhuǎn)錄過程受抑制,但是偶爾也會發(fā)現(xiàn)它有激活轉(zhuǎn)錄過程的效應(yīng)。
   本次研究通過細胞培養(yǎng)

4、實驗及轉(zhuǎn)基因小鼠在體實驗,探討了Sumo與Gli2轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性、Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響及影響這一修飾的因素及作用機制。
   第一章Sumo與轉(zhuǎn)錄因子Gli2的相關(guān)性研究
   第一節(jié)體內(nèi)實驗中Gli2蛋白與Sumo的相關(guān)性研究
   [目的]
   探究在體內(nèi)可與Gli2蛋白相互作用的修飾蛋白,證實Gli2蛋白可以發(fā)生Sumo化修飾。
   [方法]
   取胎齡

5、10.5天的野生型小鼠胚胎肢芽,將其中的信使RNA(mRNA)分離出來,反轉(zhuǎn)錄得到野生型小鼠肢芽cDNA文庫,將其重組入Pjg4-5載體。用Gli2蛋白羧基末端片段Gli2-584-1024aa來構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pNlex-Gli2-584-1024aa,使用酵母雙雜合篩選法篩選小鼠肢芽cDNA文庫,尋找可與Gli2相互作用的修飾蛋白。
   [結(jié)果]
   通過酵母雙雜合系統(tǒng)篩選胎鼠肢芽cDNA文庫得到兩個基因編碼的蛋白可

6、與Gli2相互作用,它們是Sumo2和Pias1(一個SumoE3結(jié)合酶)。通過該實驗證實在體內(nèi)Gli2蛋白存在Sumo化修飾。
   [討論]
   哺乳動物細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示,通過免疫共沉淀方法未能證實Gli2與Sumo2或Pias1存在相互作用,提示我們,這一相互作用過程很短暫。
   第二節(jié)HEK293培養(yǎng)細胞內(nèi)Gli2蛋白與Sumo的相關(guān)性研究
   [目的]
   探究在體外培養(yǎng)細胞中G

7、li2蛋白是否發(fā)生Sumo化修飾,在PDD(Gli2羧基端的一個結(jié)構(gòu)域-processingdeterminantdomain蛋白加工決定域)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的兩個Sumo化位點是否被Sumo修飾。
   [方法]
   1、將HA標記的Sumo2基因HA-Sumo2、Gli2基因分別單獨及共同在細胞中表達,將細胞裂解提取蛋白,使用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用,使用HA抗體進行免疫印跡實驗,檢測細胞中Sumo與Gli2

8、蛋白是否存在相互作用;
   2、將UBC9基因(E2Sumo結(jié)合酶)和UBC9DN基因(UBC9的負性結(jié)構(gòu))分別與HA-Sumo2基因、Gli2基因一起在細胞中表達,將細胞裂解提取蛋白,使用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用,使用HA抗體進行免疫印跡實驗,檢測有無Sumo結(jié)合酶基因共表達的細胞中Sumo化的Gli2蛋白表達量是否有區(qū)別;
   3、將GST融合野生型PDD基因、變異型PDD基因(PDD中兩個Sumo

9、化位點突變)分別與HA-Sumo2基因一起在細胞中表達,將細胞裂解提取蛋白,經(jīng)GST融合蛋白沉降技術(shù)沉降蛋白,使用HA抗體進行免疫印跡實驗,檢測有無Sumo化位點突變的PDD基因共表達的細胞中Sumo化的Gli2蛋白表達量是否有區(qū)別。
   [結(jié)果]
   1、只有當HA-Sumo2與Gli2在細胞中共表達時才能檢測到Sumo化的Gli2蛋白的免疫反應(yīng)信號,各自單獨表達時則不能;
   2、將UBC9與Gli2、

10、Sumo2共表達時可顯著提高Gli2蛋白Sumo化修飾的水平,而UBC9DN與上述兩個基因共表達時則完全抑制Gli2蛋白Sumo化修飾;
   3、Gli2蛋白Sumo化修飾在野生型PDD表達的細胞可以監(jiān)測到,但在單個或兩個Sumo化位點突變的變異型PDD表達的細胞Sumo化修飾顯著減少或徹底消失。
   [討論]
   因為免疫沉淀反應(yīng)發(fā)生在蛋白變性以后,所以實驗1中檢測到的信號應(yīng)該是Sumo化修飾的Gli2,

11、而不是與Gli2相互關(guān)聯(lián)的蛋白;實驗2表明Gli2蛋白Sumo化修飾是特異性的;實驗3表明在細胞內(nèi)PDD結(jié)構(gòu)域中兩個Sumo化位點被Sumo修飾。
   第二章體內(nèi)外研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
   第一節(jié)體內(nèi)實驗中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
   [目的]
   探究Sumo化修飾在體內(nèi)Hh信號通路中的作用及在體內(nèi)對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響。
   [方法

12、]
   制備攜帶變異型Gli2基因Gli2K2R的突變小鼠(將Gli2K630、K716位置的Sumo化位點突變),選取野生型和突變型El0.5胚胎,提取蛋白,用包含特異的Gli結(jié)合位點的雙鏈寡核苷酸將Gli2蛋白富集濃縮,免疫印跡分析使用Gli2抗體,檢測該突變小鼠體內(nèi)Gli2蛋白加工過程是否受影響;其次測定發(fā)育中的胎鼠神經(jīng)管上神經(jīng)元細胞的特異性分化和圖式發(fā)育(該過程與Hh信號通路有密切關(guān)系):雌鼠受孕10.5天后,將其處死

13、,取胚胎固定、包埋,制備冰凍切片,使用相應(yīng)抗體對組織切片行免疫染色,熒光顯微鏡下觀察切片。
   [結(jié)果]
   1、成功制備Gli2K2R突變小鼠后,檢測突變小鼠體內(nèi)Gli2蛋白表達水平,結(jié)果表明突變體Gli2K2R與野生型Gli2蛋白表達水平相當。
   2、在野生型胚胎,底板、V3祖細胞、運動神經(jīng)元在腹側(cè)神經(jīng)管的特定區(qū)域特化和圖式發(fā)育。他們分別可被轉(zhuǎn)錄因子FOXA2,NKX2.2,andHB9andISl1

14、表達標記。NKX6.1的表達從底板覆蓋至V1祖細胞。與此相反,PAX6、PAX7的表達位于背側(cè)神經(jīng)管,他們兩個分別在腹側(cè)神經(jīng)管的大部分和全部區(qū)域表達缺失,因為他們的表達被Hh信號抑制。與野生型胚胎相比,這些轉(zhuǎn)錄因子在突變型Gli2K2R純合子胚胎神經(jīng)管上的表達和圖式發(fā)育無明顯差別。使用lacZ報告基因嵌入Ptch1位置,Ptch1-lacZ在Gli2突變型胚胎神經(jīng)管上的表達與野生型Gli2胚胎相比輕微增高,并且在背側(cè)分布更廣。
 

15、  [討論]
   Ptch1是Gli2轉(zhuǎn)錄作用的靶基因,Ptch1表達增強表明Gli2轉(zhuǎn)錄活性增強。因此,該實驗表明在小鼠體內(nèi),突變型Gli2K2R活性比野生型Gli2輕微增高,表明在體內(nèi)Sumo化修飾抑制Gli2轉(zhuǎn)錄活性。
   第二節(jié)細胞培養(yǎng)研究中Sumo化修飾對Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響
   [目的]
   使用雞胚肢芽原代細胞微團培養(yǎng),體外實驗中測定Sumo修飾對于Gli2蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響

16、。
   [方法]
   制備攜帶兩個Sumo化位點K630、K716單個或全部突變的變異型Gli2基因的載體質(zhì)粒(pRKGli2K630R、pRKGli2K716R、pRKGli2K630/716R),將熒光素酶報告基因質(zhì)粒、海腎熒光素酶內(nèi)參質(zhì)粒、pRK-Gli2及上述攜帶變異Gli2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入雞胚肢芽微團培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)36小時后裂解細胞,使用雙熒光素酶報告基因檢測盒檢測各類轉(zhuǎn)染細胞熒光素酶活性,與海腎熒光素酶活

17、性標準化后,繪制熒光素酶相對活性圖表。
   [結(jié)果]
   過度表達的野生型Gli2蛋白使報告基因活性增高約10倍,Gli2K630R、Gli2K716R蛋白使報告基因活性增高的程度比野生型Gli2蛋白輕微增高,而Gli2K630/716R蛋白使報告基因活性增高約30余倍。
   [討論]
   這些結(jié)果表明,Sumo化修飾使Gli2轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。在培養(yǎng)細胞中,單個Sumo化修飾位點作用不明顯而各個

18、Sumo化修飾位點相互協(xié)同,共同作用,對Gli2轉(zhuǎn)錄活性起明顯抑制作用。
   第三章Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素及作用機制研究
   第一節(jié)Gli2蛋白Sumo化修飾的影響因素
   [目的]
   PKA磷酸化可抑制Gli2蛋白活性,而Hh信號可促進Gli2蛋白活性激活,因此我們想知道Gli2蛋白Sumo化修飾是否也會受PKA磷酸化和Hh信號的影響。
   [方法]
   1、

19、使用雞胚肢芽原代細胞微團培養(yǎng),將野生型Gli2基因及6個磷酸化位點中單個或多個位點突變的變異型Gli2基因分別與HA-Sumo2基因一起在雞胚肢芽微團培養(yǎng)細胞中表達,將細胞裂解提取蛋白,用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用,用HA抗體行免疫印跡實驗,測定不同磷酸化位點突變情況下Gli2蛋白Sumo化修飾水平的變化;
   2、將Gli2基因和HA-Sumo2基因單獨或一起在雞胚肢芽微團細胞中表達,加入ShhN條件培養(yǎng)液,培養(yǎng)

20、過夜后裂解細胞提取蛋白,用Gli2抗體對細胞蛋白進行免疫沉淀作用,用HA抗體進行免疫印跡實驗,測定Hh信號對于Gli2蛋白Sumo化修飾水平是否有影響。
   [結(jié)果]
   1、在磷酸化位點突變的Gli2基因表達的細胞中,與野生型Gli2蛋白Sumo化修飾的水平相比,變異型Gli2P5-6蛋白Sumo化修飾水平略降低,變異型Gli2P1-4蛋白Sumo化修飾水平降低明顯,變異型Gli2P1-6蛋白Sumo化修飾水平降低

21、最為明顯。
   2、對表達Gli2基因和HA-Sumo2基因的細胞使用ShhN條件培養(yǎng)液,施加Hh信號刺激,與使用普通培養(yǎng)液表達相同基因的細胞相比,Gli2蛋白Sumo化修飾水平降低。
   [討論]
   這些結(jié)果顯示,6個PKA磷酸化位點的突變和Hh信號刺激都可以抑制Gli2蛋白Sumo化修飾作用,提示我們,PKA對Gli2蛋白的磷酸化過程對Gli2蛋白Sumo化修飾有正性調(diào)節(jié)作用。
   第二節(jié)G

22、li2蛋白Sumo化修飾作用機制的研究
   [目的]
   探究Sumo化修飾對Gli2轉(zhuǎn)錄活性抑制的分子作用機制,研究野生型Gli2、突變型Gli2與組蛋白脫乙酰酶(HDACs)之間的相互作用。
   [方法]
   將野生型Gli2基因和兩個Sumo化位點突變的變異型Gli2基因Gli2K630/716R與flag標記的HDAC4基因和HDAC5基因分別在HEK293細胞中表達,將細胞裂解提取蛋白,

23、各取少量細胞蛋白分別用Flag抗體和Gli2抗體行免疫印跡實驗,剩余大部分細胞蛋白用Gli2抗體行免疫沉淀作用,然后用Flag抗體行免疫印跡實驗,測定各類基因的蛋白表達量。
   [結(jié)果]
   1、HDAC4蛋白表達水平比HDAC5表達水平要低。
   2、免疫共沉淀實驗表明,Gli2抗體可以沉淀殘余的HDAC5,即便Gli2蛋白沒有過表達。當Gli2與HDAC5共表達的時候,HDAC5被沉淀的蛋白量明顯增高。

24、
   3、當HDAC5與Gli2K630/716R共表達的時候,HDAC5被沉淀的蛋白量與其單獨表達時候的蛋白量相近。
   4、當HDAC4與Gli2或Gli2K630/716R共表達時,HDAC4被沉淀的蛋白量相似。
   [討論]
   與HDAC4相比,Gli2優(yōu)先與HDAC5相結(jié)合。只有Gli2能與HDAC5結(jié)合,而Gli2K630/716R不能與HDAC5相結(jié)合。我們的結(jié)論是Sumo化修飾抑

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