牙髓和牙周韌帶細(xì)胞體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)礦化的基因表達(dá)研究.pdf

1、牙髓和牙周韌帶組織再生修復(fù)是構(gòu)建組織工程生物牙根的關(guān)鍵，其目標(biāo)是重建具有生物學(xué)活性和功能的組織。人牙髓細(xì)胞(dental pulp cells，DPCs)和牙周韌帶細(xì)胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是構(gòu)建生物牙根的種子細(xì)胞，具有克隆形成、自我更新和多向分化能力。由于牙髓和牙周韌帶組織來源和生物學(xué)功能不盡相同，DPCs和PDLCs性能各異。比較研究DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)礦化的基因表達(dá)，對口

2、腔組織工程提供可靠的種子細(xì)胞來源有重要意義。細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境與細(xì)胞多能性維持有緊密關(guān)系。長期體外培養(yǎng)可使細(xì)胞增殖和分化能力進(jìn)行性下降。應(yīng)激狀態(tài)可激活相關(guān)信號通路，促使體細(xì)胞去分化，行使修復(fù)功能，改變培養(yǎng)條件和微環(huán)境可能誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)去分化。如何使靜止期的細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，由已分化狀態(tài)去分化為未分化狀態(tài)，從而改變細(xì)胞性狀，尚需進(jìn)一步研究。牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體和牙周附著裝置修復(fù)再生是復(fù)雜的生物過程，涉及細(xì)胞增殖、遷移、分化、修復(fù)性組織形成等，受

3、Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。目前，關(guān)于DPCs和PDLCs體外誘導(dǎo)分化和組織再生的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，對人牙源性細(xì)胞分化的分子標(biāo)記和調(diào)控信號研究將有助于闡明牙組織修復(fù)再生機(jī)制。
　　 本研究采用實時熒光定量RT-PCR芯片等方法檢測DPCs和PDLCs體外連續(xù)培養(yǎng)過程中干細(xì)胞相關(guān)基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表達(dá)變化，揭示細(xì)胞多能性維持和細(xì)胞老化的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步探索體外培養(yǎng)細(xì)

4、胞多能性維持的方法提供新思路；比較DPCs和PDLCs體外成牙本質(zhì)/成骨分化的能力及差異表達(dá)基因變化，揭示成牙本質(zhì)/成骨分化的信號調(diào)控機(jī)制，對利用DPCs和PDLCs進(jìn)行臨床治療有積極意義。本研究分為兩個部分：
　　 第一章：干細(xì)胞相關(guān)基因在體外培養(yǎng)的牙髓和牙周韌帶-細(xì)胞的表達(dá)。
　　 目的：檢測DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)過程干細(xì)胞相關(guān)基因Sox2、Oct-4和c-Myc的表達(dá)，探討體外連續(xù)培養(yǎng)對干細(xì)胞性能的影響，揭示

5、干細(xì)胞相關(guān)基因?qū)w外培養(yǎng)牙源性細(xì)胞多能性的調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：取成人健康阻生第三磨牙或正畸拔除雙尖牙的牙髓和牙周韌帶組織，免疫熒光染色檢測體外培養(yǎng)組織Sox2、Oct-4和c-Myc的表達(dá)，未經(jīng)體外培養(yǎng)的組織為對照組。組織塊接種法培養(yǎng)DPCs和PDLCs，取第0、2和7代細(xì)胞，免疫熒光染色和實時定量熒光RT-PCR檢測Sox2、Oct-4和c-Myc表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：免疫熒光顯示Sox2、Oct-4和c

6、-Myc在體外培養(yǎng)4w的組織呈陽性表達(dá)，對照組無表達(dá)。Sox2、Oct-4和c-Myc熒光表達(dá)隨傳代由細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，第0和第2代間細(xì)胞核陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，第7代細(xì)胞核陽性率顯著降低(p＜0.05)。實時定量熒光RT-PCR顯示Sox2和Oct-4 mRNA在DPCs和PDLCs體外傳代培養(yǎng)中呈相似的表達(dá)模式，隨DPCs和PDLCs傳代先上升后下降(p＜0.05)；c-Myc mRNA隨DPCs傳代先上升后下降

7、，而隨PDLCs傳代持續(xù)上調(diào)(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：細(xì)胞體外培養(yǎng)微環(huán)境可激活DPCs和PDLCs中干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，DPCs和PDLCs體外培養(yǎng)過程可能存在自發(fā)去分化。擴(kuò)增早期的DPCs和PDLCs中Sox2、Oct-4和c-Myc表達(dá)水平較高，是應(yīng)用于口腔再生醫(yī)學(xué)的理想模型。Sox2和Oct-4在牙源性細(xì)胞體外連續(xù)培養(yǎng)中呈相似的表達(dá)模式，可能對細(xì)胞多能性維持存在協(xié)同調(diào)控作用。
　　 第二章：牙髓和牙周韌帶細(xì)胞

8、的礦化能力比較研究。
　　 目的：誘導(dǎo)礦化DPCs和PDLCs，檢測和比較DPCs和PDLCs礦化能力，為闡明兩種細(xì)胞礦化過程的信號調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)。
　　 方法：酶消化法培養(yǎng)DPCs和PDLCs，取第3代細(xì)胞培養(yǎng)于成牙本質(zhì)/成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。Von Kossa染色，ImageJ軟件圖象分析。取礦化誘導(dǎo)0、7、14和21d的細(xì)胞，檢測ALP和鈣離子活性變化，統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果：礦化誘導(dǎo)14d，DPCs和P

9、DLCs分泌礦化基質(zhì)，Von Kossa染色顯示礦化結(jié)節(jié)形成，ImageJ結(jié)果示兩者礦化結(jié)節(jié)數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，PDLCs礦化結(jié)節(jié)面積顯著大于DPCs(p＜0.05)。礦化誘導(dǎo)7、14和21d，PDLCs的鈣離子活性均顯著高于DPCs(p＜0.05)；礦化誘導(dǎo)14d，PDLCs的ALP活性顯著高于DPCs(p＜0.05)，其余時間點(diǎn)兩者ALP活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論：酶消化法分離培養(yǎng)的

10、DPCs和PDLCs經(jīng)誘導(dǎo)可向成牙本質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化，PDLCs的礦化結(jié)節(jié)面積、ALP活性和鈣離子活性均顯著高于DPCs，提示體外培養(yǎng)的PDLCs礦化能力強(qiáng)于DPCs。
　　 第三章：牙髓和牙周韌帶細(xì)胞向成牙本質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化的基因表達(dá)研究。
　　 目的：檢測和比較DPCs和PDLCs向成牙本質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化的差異表達(dá)基因，尋找DPCs和PDLCs分化的分子標(biāo)記，揭示DPCs和PDLCs分化及組織再生的調(diào)控機(jī)制。<

11、br>　　 方法：取第3代DPCs和PDLCs礦化誘導(dǎo)14d，實時熒光定量RT-PCR芯片檢測誘導(dǎo)前后差異表達(dá)基因，數(shù)據(jù)分析并篩選表達(dá)差異大于3倍的基因；建立大鼠牙髓牙周聯(lián)合損傷修復(fù)模型，免疫熒光染色驗證部分差異表達(dá)基因。
　　 結(jié)果：礦化誘導(dǎo)后，DPCs和PDLCs分別有差異表達(dá)基因7和16個，其中DPCs5個基因上調(diào)，2個基因下調(diào)；PDLCs5個基因上調(diào)，11個基因下調(diào)。細(xì)胞處于未分化狀態(tài)時，PDLCs中6個基因表達(dá)顯著高

12、于DPCs，4個基因表達(dá)顯著低于DPCs；礦化誘導(dǎo)后，PDLCs中4個基因表達(dá)顯著高于DPCs，10個基因表達(dá)顯著低于DPCs。DPCs和PDLCs礦化過程涉及Notch、Wnt、TGF-β/BMP及Cadherin等信號通路(APC、DLL1、CCND2、BMP2和CDH1)。免疫熒光染色檢測BMP2和CDH1在大鼠牙髓牙周聯(lián)合損傷修復(fù)中的表達(dá)，與實時熒光定量RT-PCR芯片結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：獲得DPCs和PDLCs向成