結(jié)晶型NiS誘發(fā)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的表觀遺傳改變.pdf

1、研究背景： 鎳及其化合物是人類在職業(yè)和環(huán)境中廣泛接觸的一類金屬化學(xué)物，具有多系統(tǒng)、多器官、多細(xì)胞毒性。在多種生產(chǎn)過程中，如鎳采礦、精煉、電鍍、鎳—鎘電池制造、不銹鋼的制造以及含鎳固體廢物的焚燒等都可在周圍環(huán)境中產(chǎn)生大量含鎳煙霧，人們可以因職業(yè)暴露和非職業(yè)暴露接觸。鎳化合物可經(jīng)過多種途徑進(jìn)入機(jī)體，其中吸入接觸是人類暴露于鎳的主要方式。人群職業(yè)流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均己證實(shí)鎳的暴露可以引起腫瘤，主要為呼吸道腫瘤。國際癌癥研究中心已于

2、1990年將鎳及其化合物列為第一類致癌物。鎳致癌的機(jī)制極其復(fù)雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)鎳可以損傷基因組DNA、誘導(dǎo)基因組的表觀遺傳變異、產(chǎn)生ROS、活化腫瘤相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路、以及影響與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的活性，但其確切的致癌機(jī)制仍未完全明了。由于鎳化合物的低誘變性及強(qiáng)致癌性，提示表觀遺傳學(xué)改變可能在鎳致癌過程中起作重要作用，故目前研究熱點(diǎn)主要集中于其表觀遺傳致癌機(jī)制。 表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是與遺傳學(xué)(genet

3、ics)相對(duì)應(yīng)的概念。在生物體內(nèi)，遺傳學(xué)信息提供了生命所必需的蛋白質(zhì)的模板；而表觀遺傳學(xué)的信息提供了何時(shí)、何處和何種方式應(yīng)用這些遺傳學(xué)信息的指令，在時(shí)空順序上控制基因的表達(dá)，它不涉及DNA序列改變但又可以通過細(xì)胞分裂遺傳給子代細(xì)胞。表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要涉及DNA甲基化、組蛋白翻譯后修飾、染色質(zhì)重塑以及MicroRNA、SiRNA等。目前，表觀遺傳學(xué)研究已成為后基因組時(shí)代的生命科學(xué)研究的核心和熱點(diǎn)之一。表觀遺傳學(xué)異常常導(dǎo)致人類多種疾病，特別

4、在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，表觀遺傳學(xué)改變起重要作用。 為了探討這些問題，本課題將利用該轉(zhuǎn)化模型，檢測(cè)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中基因組總體DNA甲基化水平，篩選表觀遺傳學(xué)失活的相關(guān)DNA修復(fù)基因，分析其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，以期揭示鎳致癌過程中表觀遺傳作用，尋找鎳致癌早期可能的表觀遺傳生物標(biāo)記物，為其應(yīng)用于鎳作業(yè)人群的研究提供理論依據(jù)。 方法： 1.細(xì)胞染毒：分別以0.25μg/cm2，0.5μg/cm2，1.0μg/cm2，2

5、.0μg/cm2結(jié)晶型NiS處理人支氣管上皮細(xì)胞系(16HBE)24 h，隔天再次進(jìn)行相同處理，分別處理1、2、3次。 3.應(yīng)用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Q-PCR)及Western Blot方法檢測(cè)結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中相關(guān)DNA修復(fù)基因(MGMT、hMLH1、hMSH6、BRCA1)的變化； 4.建立甲基化熒光PCR(MethyLight)技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)和亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)定量分析結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)

6、胞中MGM7基因啟動(dòng)子CpG島DNA甲基化改變；同時(shí)分析DAC對(duì)MGMT基因CpG島啟動(dòng)子DNA甲基化的影響； 5.應(yīng)用Q-PCR及Western Blot方法檢測(cè)結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)和DNA甲基化結(jié)合蛋白(MeCP2、MBD2)的變化； 6.應(yīng)用RNAi技術(shù)建立DNMT1缺陷的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株(NSTC2shDNMT1)，并應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)分析NSTC

7、2shDNMT1細(xì)胞中MGM7基因CpG島啟動(dòng)子DNA甲基化的水平； 7.建立定量染色質(zhì)免疫沉淀(Q-ChIP)技術(shù)，并檢測(cè)結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的改變；同時(shí)分析DAC和TSA對(duì)MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)組蛋白修飾的影響； 8.應(yīng)用Q-ChIP技術(shù)檢測(cè)結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結(jié)合蛋白的結(jié)合力水平；同時(shí)分析DAC和shDNMT1對(duì)MGMT

8、基因啟動(dòng)子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結(jié)合蛋白的結(jié)合力的影響。 結(jié)果： 1.5-mC甲基化免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞DNA甲基化免疫熒光的強(qiáng)度均有不同程度降低，轉(zhuǎn)化細(xì)胞DNA甲基化免疫熒光的強(qiáng)度明顯降；Sss1甲基轉(zhuǎn)移酶法定量分析結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，0.25μg/cm2、0.5μg/cm2、1.0μg/cm2、2.0μg/cm2的結(jié)晶型NiS處理3次的細(xì)胞基因組總體甲基化程度分別降低了4.9％、

9、8.1％、19.6％、17.7％，轉(zhuǎn)化細(xì)胞(NSTC1、NSTC2)基因組總體甲基化程度降低更為顯著，分別降低了43.6％和46.8％。結(jié)果表明結(jié)晶型NiS誘發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中，整體基因組DNA甲基化水平降低。 2.Q-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，結(jié)晶型NiS處理細(xì)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中hMLH1、hMSH6、BRCA1基因表達(dá)無明顯改變，而MGMT基因表達(dá)下調(diào)，并在NiS處理細(xì)胞中存在劑量依賴關(guān)系，

10、在NiS轉(zhuǎn)化細(xì)胞中已表達(dá)缺失；Q-PCR、Western Blot及免疫熒光分析證實(shí)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC和組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可分別回復(fù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因的表達(dá)，結(jié)果提示在NiS誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中MGMT基因表達(dá)的下調(diào)及失活是受表觀遺傳調(diào)控。 3.成功建立了甲基化熒光PCR(MethyLight)技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)定量分析結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子CpG島(甲基化熱點(diǎn)區(qū)域2)DNA

11、甲基化模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的NiS處理細(xì)胞中MGMT基因CpG島啟動(dòng)子DNA甲基化水平有一定升高，甲基化參照百分比(PMR)分別為2.4％、4.5％、4.8％和6.8％；轉(zhuǎn)化細(xì)胞MGMl瑾因CpG島啟動(dòng)子DNA甲基化水平顯著升高，甲基化參照百分比(PMR)分別為74.6％和53.8％，DAC和TSA分別處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，DNA甲基化水平顯著降低。亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步分析NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因CpG島啟動(dòng)子(甲基化熱點(diǎn)

12、區(qū)域1)DNA甲基化水平，結(jié)果顯示，NiS處理細(xì)胞(NiS2)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞(NSTC2)MGMT基因甲基化水平分別為25.6％和68.9％，而陰性對(duì)照組細(xì)胞僅為7.5％；DAC處理轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，DNA甲基化水平下降了77.4％。結(jié)果表明，在NiS誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，MGMT基因啟動(dòng)子CpG島DNA高甲基化是其表達(dá)下調(diào)或失活的重要原因。 4.Q-PCR和Western Blot方法檢測(cè)DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)

13、和DNA甲基化結(jié)合蛋白(MeCP2、MBD2)的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD2表達(dá)無明顯改變，而DNMT1表達(dá)上調(diào)，在NiS處理細(xì)胞中升高了1.6～2.0倍，而在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中升高了2.6～3.4倍，提示在NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中DNMT1可能是引起DNA高甲基化的重要調(diào)控因子。為此，應(yīng)用RNAi技術(shù)成功建立DNMT1缺陷的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株(NSTC2shDNMT

14、1)，并應(yīng)用亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)分析NSTC2shDNMT1細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子CpG島DNA甲基化的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGMT基因甲基化水平降低了70.4％，提示DNMT1在維持MGM7基因啟動(dòng)子CpG島DNA高甲基化過程中起重要作用。 5.成功建立了定量染色質(zhì)免疫沉淀(Q-ChIP)技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)定量分析組蛋白修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中組蛋白H4，組蛋白H3K9乙?；浇档停M蛋白H

15、3K9雙甲基化水平升高；DAC和TSA均可逆轉(zhuǎn)NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中組蛋白修飾的改變。結(jié)果表明，在NiS誘發(fā)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，MGMT瑾因啟動(dòng)子區(qū)高組蛋白H3K9雙甲基化、低組蛋白H4和組蛋白H3K9乙酰化是其表達(dá)抑制的重要表觀遺傳學(xué)特征。 6.Q-CHIP技術(shù)檢測(cè)結(jié)晶型NiS處理細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)DNMT1和DNA甲基化結(jié)合蛋白的結(jié)合力水平，發(fā)現(xiàn)DNMT1、甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)和甲基化DN

16、A結(jié)合域蛋白2(MBD2)在MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合水平升高，而甲基化DNA結(jié)合域蛋白1(MBD1)的結(jié)合水平與陰性對(duì)照組細(xì)胞中水平相似，均表現(xiàn)為結(jié)合力低下。結(jié)果表明，DNMT1、MeCP2和MBD2被共同募集至MGMT基因CpG島啟動(dòng)子區(qū)，負(fù)責(zé)維持MGMT基因啟動(dòng)子CpG島DNA高甲基化，參與MGMT基因表達(dá)抑制的調(diào)控。ChIP-MSP技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了DNMT1、MeCP2與MGMT基因啟動(dòng)子CpG島高甲基化高度相關(guān)。 結(jié)論：