永生化人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中不同形態(tài)集落來源細胞的研究.pdf

1、評價化學(xué)物致癌性，主要依靠哺乳動物長期誘癌實驗。但其實驗周期長，飼養(yǎng)條件要求嚴格，受試動物的敏感性和給藥劑量常影響實驗結(jié)果。而哺乳動物細胞的體外惡性轉(zhuǎn)化實驗既能反映化學(xué)物的致癌性，又能彌補動物誘癌實驗的不足。因此，作為對長期誘癌實驗的補充其結(jié)果具有重要參考價值。細胞體外惡性轉(zhuǎn)化實驗的起始點是致癌物導(dǎo)致細胞遺傳物質(zhì)改變，終點是細胞成瘤能力的改變，轉(zhuǎn)化過程中則伴隨有細胞形態(tài)、細胞生長能力、生化表型等的變化。本實驗就以致癌物作用人支氣管上皮細

2、胞后傳代細胞集落的形態(tài)學(xué)改變?yōu)榍腥朦c，尋找人源細胞體外轉(zhuǎn)化的早期形態(tài)學(xué)標志，持續(xù)觀察由不同形態(tài)集落而來的兩株細胞隨傳代其生長特性、細胞構(gòu)成、細胞遺傳物質(zhì)及細胞成瘤能力的變化，進而探討肺腫瘤組織發(fā)生、人源細胞體外轉(zhuǎn)化的形態(tài)學(xué)標志和基因組學(xué)改變等問題。期望建立一種以人源細胞為實驗材料的化學(xué)物致癌性評價簡化模型。 本研究在我室袁素波、陳光宇、周拮等人先后進行的賽替派(Thiotepa，TEPA)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphami

3、de，CP)誘發(fā)永生化人支氣管上皮細胞株BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化、裸鼠接種成瘤及轉(zhuǎn)化細胞、腫瘤細胞生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)化機理研究的基礎(chǔ)上，分別以遺傳毒性致癌物賽替派、絲裂霉素C(MitomycinC，MMC)、環(huán)磷酰胺和非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、丁基羥甲苯(butylatedhydroxytoluene，BHT)對BEAS-2B細胞進行染毒，克隆接種。一方面觀察比較所產(chǎn)生的集落形態(tài)學(xué)上的差異，另

4、一方面以電鏡、免疫細胞化學(xué)染色、核型分析、基因芯片、裸鼠接種成瘤等技術(shù)對賽替派染毒BEAS-2B后兩種不同形態(tài)集落來源的細胞的生長特性、細胞構(gòu)成、遺傳物質(zhì)改變及其致癌性進行研究。主要實驗結(jié)果如下： 在遺傳毒性致癌物賽替派、環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C染毒BEAS-2B細胞一定時間后，其傳代細胞可形成兩種形態(tài)差異很大的集落(克隆)：一種集落與BEAS-2B細胞集落相似，細胞呈紡錘形、長梭形，胞核卵圓，胞漿少而淡染，細胞排列松散，呈放射狀或

5、略呈車輪狀，我們稱之為松散型集落(S-colony)；另一種集落為數(shù)比較少，胞體大而圓，胞漿豐富，核嗜堿深染，細胞排列緊密，集落呈圓形邊緣向外擴展，局部細胞有復(fù)層生長現(xiàn)象，我們稱之為緊湊型集落(C-colony)。而非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤、丁基羥甲苯作用BEAS-2B后卻無此現(xiàn)象發(fā)生。提示緊湊型集落的產(chǎn)生與細胞遺傳物質(zhì)的損傷有關(guān)聯(lián)。 我們選取賽替派染毒BEAS-2B細胞后產(chǎn)生的兩種不同形態(tài)集落(S-colony和C-col

6、ony)及BEAS-2B細胞，HE染色后，應(yīng)用Mias-300計算機顯微圖像分析系統(tǒng)測量它們的形態(tài)學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)C-colony細胞在核面積、漿面積、周長、等效直徑等方面大于S-colony和BEAS-2B細胞，也圓于這兩種細胞。 把賽替派染毒BEAS-2B細胞后產(chǎn)生的松散型集落和緊湊型集落分離，擴大培養(yǎng)，細胞建株，分別命名為BEAS-S和BEAS-C細胞。它們除在細胞形態(tài)上存在差異外，在細胞生長動力學(xué)方面也存在差異。BEAS-2

7、B和BEAS-S細胞生長速率快于BEAS-C細胞，克隆形成率高于BEAS-C細胞，飽和密度大于BEAS-C細胞。但只有BEAS-C細胞中有緊湊型集落和轉(zhuǎn)化灶產(chǎn)生。BEAS-S、BEAS-C細胞與BEAS-2B細胞相比，G0/G1期細胞減少，S期細胞增加，G2/M期細胞比例在其早代細胞中高于對照細胞，隨著細胞傳代，G2/M期細胞的比例恢復(fù)至正常狀態(tài)，但S期細胞比例仍高于對照。 對BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細胞進行考

8、馬斯蘭染色觀察其細胞骨架，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細胞骨架系統(tǒng)排列有序，無紊亂；BEAS-S細胞骨架系統(tǒng)稍有紊亂，不明顯；而BEAS-C細胞可觀察到骨架系統(tǒng)明顯紊亂。提示賽替派通過對細胞骨架的影響而使細胞形態(tài)、集落形態(tài)發(fā)生變化。對BEAS-C細胞進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)賽替派對人支氣管上皮細胞有明顯細胞毒作用，細胞損傷比較嚴重，部分細胞胞漿、胞核中有空泡，染色質(zhì)有邊集現(xiàn)象。 使用人支氣管上皮基底細胞特異標志物——角蛋白34βE12抗體、杯狀

9、細胞特異標志物——粘蛋白5AC(Mucin5AC，MUC5AC)抗體和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞特異標志物——嗜鉻素A(ChromograninA，ChrA)抗體對3株細胞進行免疫細胞化學(xué)染色(PowerVisionTM兩步法)。發(fā)現(xiàn)在3株細胞中均無ChrA表達；MUC5AC表達為弱陽性；34βE12在BEAS-2B和BEAS-S細胞中表達不隨代齡增加而明顯改變，在BEAS-C細胞，隨著代齡增加，34βE12表達明顯增強。表明基底細胞可能是人支氣管

10、上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化的干細胞。 對3株細胞進行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細胞染色體數(shù)目穩(wěn)定，也未見非穩(wěn)定性畸變；而BEAS-S和BEAS-C細胞均可見雙著絲粒染色體和少量染色體斷片，發(fā)生率以BEAS-C3P和BEAS-S32P最高，分別為8％和9％。BEAS-C細胞隨著傳代四倍體的比率逐漸升高，最終成為細胞的主體，而BEAS-S細胞染色體數(shù)目的改變不明顯。每株細胞分析3個核型，其中BEAS-S32P和BEAS-C32P細胞分

11、別有1個和2個核型異常，以BEAS-C細胞異常最為明顯。 使用BiostarH-20s基因芯片對3株細胞部分基因的表達進行兩兩分析比較。將在BEAS-Cvs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共44項，其中下調(diào)基因19個，上調(diào)基因25個；將在BEAS-Svs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共14項，其中下調(diào)基因8個，上調(diào)基因6個；將在BEAS-Cvs.BEAS-S組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共181項，

12、其中下調(diào)基因53個，上調(diào)基因128個。分析結(jié)果還顯示BEAS-C細胞在某些與腫瘤相關(guān)基因的表達上異于其它兩株細胞。我們從基因芯片實驗結(jié)果中選取差異明顯的5條基因CTNNB1、CD44、RHOC、ID3、TGFA通過RT-PCR實驗進行驗證。發(fā)現(xiàn)在它們在3株細胞中的相對含量用兩種方法所測結(jié)果大體上一致，但在數(shù)值上有些差別。 BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細胞在成瘤性上存在差異：PHA(phytohaemagglutin

13、in)凝集實驗中，BEAS-C細胞凝集性明顯強于BEAS-2B和BEAS-S細胞；軟瓊脂集落形成實驗中，BEAS-C細胞在第28代開始長出集落，而BEAS-2B和BEAS-S細胞在軟瓊脂中始終未觀察到集落形成；裸鼠成瘤實驗中只有接種BEAS-C細胞的裸鼠有腫瘤生成。 本研究利用5種致癌物轉(zhuǎn)化BEAS-2B細胞，并對賽替派轉(zhuǎn)化BEAS-2B細胞后由不同形態(tài)集落而來的兩株細胞的形態(tài)學(xué)、細胞構(gòu)成、基因組學(xué)及成瘤性進行研究，得出以下主要

14、結(jié)論：①致癌物→遺傳物質(zhì)的損傷→細胞骨架系統(tǒng)的紊亂、細胞黏附性的增加→細胞形態(tài)、集落形態(tài)的變異→成瘤性的變異。因此緊湊型集落(C-colony)的出現(xiàn)可作為一個預(yù)測化學(xué)物是否具有遺傳毒性、致癌性的早期標志，但以此為依據(jù)建立一種以人源細胞為實驗材料的化學(xué)物致癌性評價簡化模型還需在更廣泛的基礎(chǔ)上進行研究。②致癌物→細胞群中基底細胞耐受細胞毒作用→受遺傳毒作用誘導(dǎo)突變→獲得生長優(yōu)勢并擴增為惡變細胞群主體，說明基底細胞可能是人支氣管上皮細胞惡性